紫草的蒙醫傳統奶炮制工藝及質量標準研究

蘇日娜，牧 丹，那生桑

(內蒙古醫科大學，內蒙古 呼和浩特 010110)

紫草為中醫和蒙醫常用藥材，最早載于《神農本草經》，歷代本草均有收載。2015年版中國藥典收載了紫草科軟紫草屬植物新疆紫草(Arnebiaeuchroma(Royle)Johnst)和內蒙紫草(ArnebiaguttataBunge)的干燥根，具有清熱涼血、活血解毒、透疹消斑的功效，用于治療血熱毒盛、斑疹紫黑、麻疹不透、瘡瘍、濕疹、水火燙傷[1]。

蒙醫藥中常稱紫草為畢日木格(《認藥白晶鑒》)，蒙醫藥古籍均有記載。《無誤蒙藥鑒》載其：“生于砂質硬土地，莖、葉具毛、葉灰色粗糙，根深紅棕色、味甘、澀者性烈，質佳……根極細，叫吉木格者次。”上述植物生境、形態特征與蒙醫所沿用的紫草環境、形態特征基本一致，故認定歷代蒙醫藥文獻所載的東日拉即畢日木格[2]。與中醫的炮制方法不同[3]，紫草油和紫草膏在蒙醫藥中的炮制方法主要有奶煮或泡、制炭兩種，這兩種炮制品藥理功效不同。《蒙藥炮制學》記載：“紫草的奶炮制品可增強肺熱的治療功效，紫草炭制后有助于治療各種原因引起的出血癥。”[4，5]本研究以傳統蒙醫炮制理論為基礎，將紫草生品經牛奶炮制后，測定其有效成分的含量，并考察炮制前后的含量變化，為今后蒙醫藥中紫草奶炮制品的質量標準及藥理實驗提供依據。

1 儀器、試藥及藥材

1.1 儀器

旋轉蒸發儀RE52CS9(上海亞榮生化儀器廠)；KH5200DE型數控超聲儀(昆山禾創超神儀器有限公司)；SHB-B95T型循環水式多用真空泵(鄭州長城科工貿有限公司)；恒溫水浴鍋B-220(上海亞榮生化儀器廠)；薄層色譜展開缸(上海信誼儀器廠有限公司)；硅膠板G(青島硅創精細化工有限公司)；玻璃毛細管(華西醫科大學儀器廠)；電熱鼓風干燥箱(上海一恒科學儀器有限公司)； TU-1901雙光束紫外可見分光光度計(北京普析通用儀器有限責任公司)；Ichromw5100(大連依利特分析儀器有限公司)。

1.2 試藥

對照品阿卡寧(中國食品藥品檢定研究院，批號：111689-201504)；新疆紫草(中國食品藥品檢定研究院，批號：121430-201504)；甲酸、甲醇和乙腈為分析純；石油醚(60～90℃)為分析純；水為Milli-Q超純水。

1.3 采集的藥材

全部批次的藥材經內蒙古醫科大學渠弼教授鑒定為紫草科植物新疆紫草(Arnebiaeuchroma(Royle)Johnst.)的干燥根。見表1。

表1 采購的紫草批號和產地

2 方法與結果

2.1 紫草奶炮制工藝流程

取新疆紫草500 g，加10倍鮮牛奶(500 mL)，煮沸。待煮到10 min后較粗的藥材完全煮透，藥材顏色變淺；將煮好的藥材轉移到燒杯中，用蒸餾水反復清洗至沒有奶漬；將清洗好的藥材放置于濾紙上鋪平，放到60 ℃的烘干箱中進行烘干，直到干燥程度與原藥材相同為止。

按煎煮時間為指標，分別測定煎煮10 min、15 min、20 min和30 min的炮制品中β,β′二甲基丙烯酰阿卡寧的含量，含量隨煎煮時間增加而降低，因為10 min內牛奶已經浸透到全部藥材內部(包括最粗的根狀藥材)，所以選擇10 min的炮制時間。

關于加入的牛奶量，根據文獻記載，10 kg的藥材浸泡要15 L的牛奶(1.5倍)。但在實驗室炮制50 g的時候，若只是加入75 mL牛奶，則不能完全浸泡藥材，所以增加了牛奶的量。炮制后的藥材具有奶香味。

2.2 薄層鑒別

2.2.1 實驗方法 取炮制品粉末0.5 g，加石油醚(60～90 ℃)20 mL，超聲處理20 min，濾過，濾液濃縮至1 mL，作為供試品溶液。另取紫草對照藥材(中國食品藥品檢定研究院，批號：121430-201504)0.5 g，同法制成對照藥材溶液。照薄層色譜法(2015版藥典通則0502)試驗，吸取兩種溶液各4 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以環己烷-甲苯-乙酸乙酯-甲酸(5∶5∶0.5∶0.1)為展開劑，展開，取出，晾干。供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應的位置上，顯相同的紫紅色斑點；再噴以10% 氫氧化鉀甲醇溶液，斑點變為藍色。見圖1。

圖1 薄層色譜

3 含量測定

3.1 羥基萘醌總色素

取本品適量，在50 ℃干燥3 h，粉碎(過三號篩)，取約0.5 g，精密稱定，置100 mL量瓶中，加乙醇至刻度，4 h內連續振搖，濾過。精密量取續濾液5mL，置25mL量瓶中，加乙醇至刻度，搖勻。照紫外-可見分光光度法(通則0401)，在516 nm波長處測定吸光度，按左旋紫草素(C16H16O5)的吸收系數E=242計算，即得。本品含羥基萘醌總色素以左旋紫草素(C16H16O5)計。見表2。

表2 新疆紫草不同樣品炮制前后羥基萘醌總色素含量變化 (%)

3.2 β,β′-二甲基丙烯酰阿卡寧的含量測定

3.2.1 色譜條件 色譜柱：Sinochrom ODS-BP(4.6 mm×250 mm,5 μm)；流動相:乙腈-0.15%甲酸水溶液(70∶30),流速：1 mL·min-1；檢測波長：275 nm；柱溫：30℃。β,β′-二甲基丙烯酰阿卡寧對照品(中國食品藥品檢定研究院，批號：111689-201504)。見圖2。

3.2.2 標準品溶液配制 稱定阿卡寧對照品6.23 mg置于10 mL容量瓶中，用乙醇溶液溶解并定容至刻度，搖勻，作為1號對照品；吸取1號對照品溶液5 mL，轉移至10 mL容量瓶中，用乙醇定容至刻度，搖勻，作為2號對照品溶液；吸取2號對照品溶液2.5 mL轉移至10 mL容量瓶中，用乙醇定容至刻度，搖勻，作為3號對照品溶液；吸取3號對照品溶液2.5 mL，轉移至10 mL容量瓶中，用乙醇定容至刻度，搖勻，作為4號對照品溶液；吸取4號對照品溶液2.5 mL轉移至10 mL容量瓶中，用乙醇定容至刻度，搖勻，作為5號對照品溶液。上述阿卡寧對照品溶液的濃度依次為1號0.632 mg/mL,2號0.316 mg/mL,3號0.079 mg/mL,4號0.02 mg/mL，5號0.002 mg/mL。

3.2.4 供試品溶液的制備 取本品粉末(過四號篩)約0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入石油醚(60～90℃)25 mL，稱定重量，超聲處理(功率250 W，頻率33kHz)30 min，放冷，再稱定重量，用石油醚(60～90℃)補足減少的重量，搖勻，濾過。精密量取續濾液10 mL，蒸干，殘渣加流動相溶解，轉移至10 mL量瓶中，加流動相至刻度，搖勻，濾過，取續濾液，即得。測定法分別精密吸取對照品溶液與供試品溶液各10 μL，注入液相色譜儀，測定，即得。見圖3。

3.3 專屬性考察

圖2、圖3為對照品及奶紫草的HPLC色譜，結果表明丙烯酰阿卡寧保留時間一致，分離度良好，HPLC測定方法專屬性良好。

圖2 β,β′-二甲基丙烯酰阿卡寧對照品的HPLC色譜

圖3 奶紫草的HPLC色譜

3.4 重現性考察

取同一批新疆紫草奶炮制樣品粉末(批號：1606102101)6份，精密稱定，按上述方法制備供試品溶液，精密吸取供試品溶液20 μL，分別進行測定，記錄色譜，計算含量。結果，β,β′-二甲基丙烯酰阿卡寧含量的RSD=2.71%。見表3。

表3 重復性考察結果

3.5 穩定性考察

精密吸取同一新疆紫草供試品溶液(批次：1606102101)20 μL，分別于0、1、2、4、8、12 h按上述色譜條件進樣測定，記錄色譜。結果，β,β′-二甲基丙烯酰阿卡寧的峰面積的RSD=0.78%。

3.6 線性范圍

精密稱取β,β′-二甲基丙烯酰阿卡寧6.32 mg，置于10 mL容量瓶中，用甲醇定容，既得0.632 mg/mL的對照品儲備液。用甲醇稀釋配制成濃度為0.316 mg/mL、0.076 mg/mL、0.02 mg/mL、0.002 mg/mL的一系列標準品溶液。濾頭過濾，吸取20 μL，按上述色譜條件測定，記錄色譜圖，以峰面積積分值(Y)為縱坐標，標準品溶液濃度(X)為 橫坐標，進行線性回歸，得線性方程為Y=2295 2X+33.915(r=0.999 9)。

3.7 加樣回收率

取已知含量的奶紫草粉末約0.25 g，共6份，精密稱定，置100 mL具塞錐形瓶中，加入一定量的對照品，使供試品中待測定組分含有量與對照品的加入量比值在1∶1.5、1∶1、1∶0.5左右，按上述方法制備供試品溶液，精密吸取供試品溶液20 μL，分別進行測定，記錄色譜，計算含量。結果見表4。

3.8 樣品含量測定

6個批次樣品各取3份，精密稱定，按上述方法制備供試品溶液，精密吸取供試品溶液20 μL，分別用外標法計算出6個批次樣品中β,β′-二甲基丙烯酰阿卡寧的含量。結果見表6。

4 討論

現代藥理學研究證明，紫草中主要活性成分為羥基萘醌色素類成分，包括紫草素及其衍生物，這類物質主要有抗炎、抗菌、抗病毒等作用[6]。針對紫草的質量控制研究有一些報道，郝鶴等[7]采用梯度洗脫 HPLC 法測定了新疆紫草中的7種萘醌類成分；Min Cheng 等[8]采用HPLC法測定了新疆紫草和內蒙紫草中的左旋紫草素和 β，β′- 二甲基丙烯酰阿卡寧的含量，并對其進行了分析；毛艷和 MEI LIAO 等[9,10]采用液質聯用技術對紫草藥材的化學成分進行了快速鑒定。

表4 加樣回收率試驗結果

表6 樣品含量測定結果

經過牛奶炮制后的紫草生品，薄層鑒別結果表明其萘醌成分沒有明顯變化，而高效液相法定量分析后發現炮制品的紫草素類化合物峰的含量均比生品降低。其中以β，β′- 二甲基丙烯酰阿卡寧對照品，測定炮制品的羥基萘醌總色素的含量為0.56%～2.5% ；β，β’-二甲基丙烯酰阿卡寧的含量為0.020%～0.52%，分別比生品低1.7%～4.2%和0.07%～0.34%。2015版藥典中記載的紫草含量測定方法通過方法學考證適用于紫草的奶炮制品。為今后的蒙醫藥中紫草的奶炮制品的質量標準及藥理實驗提供了實驗依據。