探討慢性HBV感染者外周血iNKT細胞水平變化

蘇密龍

I型NKT細胞（invariant nature killer T，iNKT）是一群由α-GalCer特異性激活的淋巴細胞，活化的iNKT細胞能夠產生IL-4、IFN-γ等多種細胞因子，參與機體免疫調節，在抗HBV復制過程中起到重要的作用[1]。研究顯示[2]，iNKT功能的下降是導致HBV病毒不能被完全清除的原因之一。慢性HBV感染者的外周iNKT細胞產生IFN-γ的能力降低，使HBV慢性感染。動物實驗結果顯示[3]，對HBV感染轉基因鼠注射α-GalCer，可使iNKT細胞活化，有利于產生IFN-γ因子，從而抑制HBV復制。本次選取48例處于不同免疫時期的慢性HBV患者，了解其外周血iNKT細胞的數量情況，以及iNKT細胞分泌細胞因子的能力，為慢性HBV感染患者的治療提供參考依據，具體報道如下。

1 資料和方法

1.1 一般資料

選取2015年1月—2018年9月我院收治的確診為慢性HBV感染者48例，分別處于免疫耐受期（13例）和免疫清除期（35例）。免疫耐受期男性9例、女性4例，年齡16～63歲，平均年齡（37.2±11.5）歲；免疫清除期男性27例、女性8例，年齡18～60歲，平均年齡（37.4±10.8）歲。納入標準：患者的診斷均符合2015中國慢性乙型肝炎防治指南版的標準[4]；排除標準：（1）因其他肝炎病毒感染的患者；（2）酒精性肝病患者；（3）納入研究前半年經過抗病毒和免疫治療的患者；（4）自身合并有其他免疫疾病。另選取同期在我院的正常體檢人群39例，男性30例、女性9例，年齡28～36歲，平均年齡（30.2±6.2）歲，耐受期組患者、清除期組患者、正常體檢組患者的性別、年齡一般資料進行對比，差異無統計學意義（P＞0.05）。

1.2 主要儀器和試劑

淋巴細胞分離液，CD3-PerCP-Cy5-5、IFN-γ-PE-Cy7、TNFα-APC、TCRVα24-FITC、TCRVβ11-PE（Beckman Coulter）、Navios流式細胞儀（Beckman Coulter）。

1.3 實驗方法

（1）采集新鮮的促凝血3 mL，靜止30 min后，使用3 000 rpm的速度，離心5 min后取上清液，以60 μL，置于-80℃環境中保存。（2）抽取肝素鈉凝血4毫升，用生理鹽水進行稀釋，再加入等體積的淋巴細胞分離上層，以800 rpm的速度離心20 min，吸取單核細胞層后，加入PBS，再以800 rpm的速度離心15 min，400rmp的速度離心5 min，留取沉淀即為外周血單核細胞（PBMC）。（3）在外周血iNKT細胞及其分泌的細胞因子TNF-α和IFN-γ比400μL外周血單核細胞懸液中加入PMA10μL，BFA 8μL和Ionomycin 8μL置入培養箱4 h，PBMC清洗離心，100 μL PBS 重懸后加入CD3-Per-CP-Cy5-5 5 μL、TCRVα24-FITC 5 μL、TCRVβ11-PE 5 μL室溫避光孵育30 min；固定、破膜后100 μL PBS 重懸細胞，加入IFN-γ-PE-Cy7 5 μL、TNFα-APC 5 μL 室溫避光孵育30 min，PBS 清洗后，加入400 μL PBS 重懸細胞。

1.4 統計學方法

使用SPSS 18.0進行數據處理，計量資料用（均數±標準差）或中位數表示，Mann-Whitney U檢驗，計數資料采用χ2檢驗，P＜0.05，差異有統計學意義

2 結果

耐受期組和清除期組患者iNKT細胞占CD3+T細胞的比例低于正常體檢組，但差異無統計學意義（U=6.316，P＞0.05），見圖1；耐受期組患者的iNKT細胞占CD3+T細胞的比例高于正常體檢組，差異無統計學意義（U=33.161，P＞0.05），清除期組患者iNKT細胞占CD3+T細胞的比例低于耐受期組和正常體檢組，差異有統計學意義（U=3.269；U=7.127，P＜0.05），見圖2。三組患者經PMA刺激后，清除期組患者分泌的IFN-γ和TNF-α占iNKT細胞比例高于正常體檢組，差異無統計學意義（U=23.137；U=28.982；U=26.163，P＞0.05），耐受期組患者比例高于清除期組和正常體檢組，差異有統計學意義（U=7.112，P＜0.05），見圖3、圖4。

圖1 耐受期組和清除期組患者iNKT細胞占CD3+T細胞的比例

圖2 不同組患者的iNKT細胞比例

圖3 不同組患者分泌的IFN-γ占iNKT 細胞比例

圖4 不同組患者分泌的IFN-α占iNKT細胞比例

3 討論

肝臟是人體最大的免疫器官，iNKT細胞在肝臟中的含量較為豐富，也同時分布在肝臟、骨髓、脾臟、外周血中，其兼具有NK細胞與T細胞的部分表型，在抗腫瘤和抑制自身免疫中有重要作用[4-7]。動物實驗結果顯示，在HBV轉基因小鼠的肝臟、脾臟等免疫器官中，iNKT細胞的數量呈現下降趨勢。張鑫的研究結果顯示[8]，iNKT細胞在HBV感染后，增殖能力存在受損的情況。

在此研究背景下，本研究結果顯示，耐受期組和清除期組患者iNKT細胞占CD3+T細胞的比例低于正常體檢組，差異無統計學意義（P＞0.05），清除期患者的外周血iNKT細胞細胞比例低于耐受期組和正常體檢組，差異有統計學意義（P＜0.05），分析原因為在慢性HBV的感染過程中，耐受期的HBV DNA刺激iNKT細胞的分泌，因此細胞比例高于正常體檢組，但隨著免疫的激活，iNKT細胞逐漸作用于肝，所以高病毒載量的清除期iNKT細胞比例開始下降，而體內的炎癥得到控制后，iNKT細胞比例也開始逐漸恢復正常。三組患者經PMA刺激后，清除期組患者分泌的IFN-γ和TNF-α占iNKT細胞比例高于正常體檢組，差異無統計學意義（P＞0.05），說明在此過程中，iNKT細胞分泌的IFN-γ和TNF-α沒有受到免疫過程的影響，IFN-γ和TNF-α起到了有效抑制HBV復制，并清除HBV的作用。

綜上所述，慢性HBV感染患者機體可通過iNKT細胞分泌的IFN-γ和TNF-α來抑制HBV的復制過程，感染過程中外周血iNKT 細胞有所數量減少[9-12]。由于本次研究受到時間和其他客觀因素的影響，未能進一步探究導致iNKT細胞比例降低的原因或是否與其他細胞因子有關，有待以后擴大樣本量再進行研究。