高效液相色譜-蒸發(fā)光散射法測(cè)定杏貝止咳顆粒中貝母素甲和貝母素乙含量

楊智慧 ，程 誠(chéng) ，高曉燕

（1.江蘇省連云港市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)中心，江蘇 連云港 222006； 2.江蘇康緣藥業(yè)股份有限公司，江蘇 連云港 222001）

杏貝止咳顆粒由麻黃、前胡、浙貝母、桔梗、苦杏仁、百部、甘草等12種中藥組方，有清宣肺氣、止咳化痰功效，臨床主要用于外感咳嗽的治療[1]。現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)為原國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局標(biāo)準(zhǔn)，該標(biāo)準(zhǔn)在定性鑒別之外，僅對(duì)苦杏仁中的苦杏仁苷進(jìn)行了含量控制[1]。方中浙貝母有清熱化痰、潤(rùn)肺止咳功效，貝母素甲和貝母素乙為其主要活性成分[2-3]。本研究中采用高效液相色譜-蒸發(fā)光散射（HPLC-ELSD）法測(cè)定兩成分含量，為完善該藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供參考。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent 1260型高效液相色譜儀，包括1260 Infinity蒸發(fā)光散射檢測(cè)器（美國(guó)Agilent公司）；BP211D型電子分析天平（德國(guó)Sartorius公司）；Milli-Q Intergral 3型超純水機(jī)（美國(guó)Millipore公司）；SK250HP型超聲波清洗儀（上海利導(dǎo)超聲儀器有限公司）。

1.2 試藥

貝母素甲對(duì)照品（批號(hào)為110750-201612，純度為96.2%），貝母素乙對(duì)照品（批號(hào)為110751-201712，純度為97.7%），均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；杏貝止咳顆粒（江蘇康緣藥業(yè)股份有限公司，批號(hào)分別為170721，170906，171108，規(guī)格為每袋 4 g）；甲醇、乙腈為色譜純，其余試劑均為分析純，水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Phenomenex C18柱（250 mm ×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：70% 乙腈溶液 （含 0.08% 二乙胺）；流速：0.8 mL/min；ELSD 漂移管溫度：85℃；載氣（氮?dú)猓┝魉伲?.1 L/min；霧化器溫度：70 ℃；進(jìn)樣量：10 μL[4-5]。

2.2 溶液制備

稱取貝母素甲、貝母素乙對(duì)照品各適量，精密稱定，加甲醇制成貝母素甲和貝母素乙質(zhì)量濃度分別為1.328 g/L和1.247 g/L的混合對(duì)照品貯備液，精密量取5 mL，置50 mL容量瓶中，加甲醇定容，搖勻，即得混合對(duì)照品溶液。取樣品適量，稱取4.003 2 g，精密稱定，置圓底燒瓶中，精密加濃氨溶液5 mL，浸潤(rùn)2 h，加氯仿 -乙酸乙酯 -甲醇（1∶7∶2，V/V/V）混合溶液 70 mL，置80℃水浴上加熱回流2 h，放冷，濾過(guò)；殘?jiān)曰旌先芤喝芙猓瑸V過(guò)，合并濾液，置100 mL容量瓶中，加混合溶液定容。精密量取續(xù)濾液50 mL，置蒸發(fā)皿中蒸干，殘?jiān)眉状既芙獠⒍ㄈ葜? mL，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。按杏貝止咳顆粒處方和工藝制備缺貝母的陰性樣品，同法制成陰性對(duì)照品溶液。

2.3 方法學(xué)考察

專屬性試驗(yàn)：取上述溶液各適量，按擬訂色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖，詳見(jiàn)圖1。結(jié)果陰性對(duì)照品溶液色譜在與貝母素甲和貝母素乙對(duì)照品溶液色譜相同保留時(shí)間處無(wú)干擾峰，說(shuō)明本試驗(yàn)專屬性良好。

圖1 高效液相色譜圖

線性關(guān)系考察：取混合對(duì)照品貯備液2.0，1.0，0.5，0.2，0.1 mL，分別置10 mL容量瓶中，加甲醇定容，制得系列混合對(duì)照品溶液，按擬訂色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。以待測(cè)對(duì)照品進(jìn)樣量（X，μg）為橫坐標(biāo)、峰面積（Y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得貝母素甲和貝母素乙回歸方程分別為Y甲=1.468 5X甲+5.901 4，r=0.999 9（n=5），Y乙=1.469 3X乙+6.225 7，r=0.999 7（n=5）。結(jié)果表明，貝母素甲和貝母素乙進(jìn)樣量分別在0.133～2.655 μg和 0.125～2.547 μg范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

檢測(cè)限和定量限測(cè)定：分別精密量取混合對(duì)照品溶液適量，倍比稀釋，按擬訂色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，以信噪比（S/N）為10∶1和3∶1分別計(jì)算定量限和檢測(cè)限。結(jié)果貝母素甲和貝母素乙定量限分別為0.132 8 μg和0.124 7 μg，檢測(cè)限分別為 0.044 26 μg 和 0.062 35 μg。

精密度試驗(yàn)：取混合對(duì)照品溶液適量，按擬訂色譜條件進(jìn)樣，連續(xù)測(cè)定6次，記錄峰面積。結(jié)果貝母素甲和貝母素乙峰面積的RSD分別為0.91%和1.09%（n=6），表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取供試品溶液（批號(hào)為170721）適量，分別于室溫下放置 0，1，3，5，8，12 h 時(shí)進(jìn)樣，按擬訂色譜條件測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果貝母素甲和貝母素乙峰面積的RSD分別為1.23%和1.42%（n=6），表明供試品溶液室溫放置12 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

重復(fù)性試驗(yàn)：稱取樣品（批號(hào)為170721）適量，精密稱定，共6份，同法制備供試品溶液，按擬訂色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并計(jì)算含量。結(jié)果貝母素甲和貝母素乙平均含量分別為每袋0.892 4 mg和1.172 6 mg，RSD分別為1.12%和1.12%（n=6），表明方法重復(fù)性良好。

加樣回收試驗(yàn)：稱取已知含量的樣品（批號(hào)為170721）適量，每份 2.0 g，共 9 份，按 80% ，100% ，120%水平分別加入混合對(duì)照品貯備液，同法制備供試品溶液，按擬訂色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積，并計(jì)算加樣回收率。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（n=9）

2.4 樣品含量測(cè)定

取樣品各適量，同法制備供試品溶液，按擬訂色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積，以外標(biāo)兩點(diǎn)法計(jì)算含量。結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 樣品含量測(cè)定結(jié)果（mg/袋，n=6）

3 討論

本試驗(yàn)中采用紫外-可見(jiàn)分光光度儀對(duì)對(duì)照品溶液進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描，貝母素甲和貝母素乙均無(wú)強(qiáng)發(fā)色基團(tuán)，紫外吸收很弱且為末端吸收，基線不穩(wěn)，背景干擾嚴(yán)重。而ELSD適用于無(wú)紫外吸收化合物的定量定性分析，基線平穩(wěn)，靈敏度較高。本試驗(yàn)中通過(guò)對(duì)不同比例的甲醇-水、乙腈-水及乙腈-水（含0.08%二乙胺）等流動(dòng)相進(jìn)行比較，結(jié)果顯示，采用乙腈-水（含0.08%二乙胺）作為流動(dòng)相時(shí)，基線噪音小，分離效果良好，各色譜峰無(wú)拖尾現(xiàn)象，且分析時(shí)間較短，保留時(shí)間適中。本試驗(yàn)中在參考文獻(xiàn)[6-8]的基礎(chǔ)上，對(duì)漂移管溫度和載氣流速進(jìn)行優(yōu)化，考察了飄移管溫度為70～100℃、載氣流速為1.5～2.2 L/min時(shí)待測(cè)成分的響應(yīng)值，結(jié)果顯示，漂移管溫度為85℃、載氣流速為2.1 L/min時(shí)，響應(yīng)值最高，色譜峰峰形和分離度均良好，且不受雜質(zhì)干擾。

本試驗(yàn)中對(duì)提取溶劑、提取方法和提取時(shí)間進(jìn)行了優(yōu)化篩選，分別以氯仿、乙酸乙酯、乙酸乙酯-甲醇（4 ∶1，V/V）、氯仿 -甲醇（4 ∶1，V/V）及氯仿 -乙酸乙酯 -甲醇（2∶7∶1，V/V/V）為提取溶劑進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果顯示，氯仿-甲醇（4∶1，V/V）和氯仿-乙酸乙酯-甲醇（2 ∶7 ∶1，V/V/V）2 種提取溶劑提取效果較好，考慮乙酸乙酯的毒性低于氯仿，故選用后者；比較了超聲、加熱回流提取2種方法的提取效果[7]，結(jié)果顯示，加熱回流提取時(shí)2種待測(cè)成分含量較高；比較了提取1，1.5，2，2.5，3 h時(shí)的提取效果，結(jié)果顯示，提取2 h后待測(cè)成分含量無(wú)明顯變化，故選擇加熱回流提取2 h；選用了50，60，70，80，90 mL 的氯仿 -乙酸乙酯 -甲醇（2∶7 ∶1，V/V/V）混合溶液進(jìn)行加熱回流提取，結(jié)果顯示，溶液量70 mL以上待測(cè)成分含量無(wú)明顯變化，故選擇70 mL混合溶液。

綜上所述，本研究中建立的方法操作簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確，精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性好，可用于杏貝止咳顆粒貝母素甲和貝母素乙的含量測(cè)定。