實心與空心微針對氨甲環酸體外經皮滲透的影響比較

陳彥彪 ，唐 驄 ，余楚欽 ，魏嘉寶 ，楊 凡 ，李苑新 △

（1.廣州納麗生物科技有限公司，廣東 廣州 511440； 2.廣東藥科大學，廣東 廣州 510006）

氨甲環酸又名傳明酸、止血環酸和凝血酸等，其退黑祛斑功效是果酸的10倍、維生素C的50倍[1]。臨床研究表明，口服或外用氨甲環酸有助于治療黃褐斑，且不良反應小，可單用或聯合其他藥物使用[2]。微針是指長度在幾十微米至幾毫米、尖端直徑幾十微米的微型針頭[3]，能刺破皮膚表面的角質層，極大地提高藥物經皮輸送效率[4]，可實現無痛、小創傷經皮給藥。為增強氨甲環酸的透皮吸收，提高其療效，本研究中采用改良Franz擴散池和高效液相色譜（HPLC）法，以離體豬皮為滲透屏障，考察實心微針、空心微針作用于豬皮對氨甲環酸注射液透皮吸收的影響，為其在美容方面的應用提供參考。現報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent 1100型HPLC儀（美國Agilent公司）；YBP6型智能透皮試驗儀（天津藥典標準儀器制造廠）；超納微晶美膚儀及其配套實心、空心微針（廣州納麗生物科技有限公司）；DW-86W100型臥式超低溫保存箱（青島海爾特種儀器有限公司）；KDC-140HR型高速冷凍離心機（安徽中科中佳科學儀器有限公司）；BP211D型電子天平（德國Sartorius公司）；KQ-500M型超聲清洗機（東莞市科橋超聲波設備有限公司）。

1.2 試藥

氨甲環酸注射液（貴州圣濟堂制藥有限公司，批號為20170401，規格為每支0.5 g∶5 mL）；氨甲環酸對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號為9Z1W-ETCD，純度為99.9%）；甲醇、磷酸為色譜純；其余試劑均為分析純，水為去離子水。

1.3 動物

廣西巴馬小型乳豬，3月齡，體質量約為20 kg，廣州南方醫大實驗動物科技發展有限公司提供，動物生產合格證號為SCXK（粵）2016-0041，批號為2017-0416。

2 方法與結果

2.1 含量測定

2.1.1 色譜條件

色譜柱：Phenomenex ODS柱（250 mm ×4.6 mm，5 μm）；流動相：0.23%十二烷基硫酸鈉溶液（稱取磷酸二氫鈉18.3 g，加水800 mL溶解，加三乙胺8.3 mL混勻，加十二烷基硫酸鈉2.3 g，振搖使溶解，用磷酸調pH至2.5，加水定容至 1 000 mL，搖勻）-甲醇（60 ∶40，V/V）；流速：1.0 mL/min；檢測波長：220 nm；柱溫：25 ℃；進樣量：20 μL[5]。

2.1.2 溶液制備

稱取氨甲環酸對照品適量，精密稱定，加水溶解，制成質量濃度為5 mg/mL的對照品溶液；取氨甲環酸注射液適量（約相當于氨甲環酸0.5 g），置100 mL容量瓶中，加水定容，搖勻，作為供試品溶液；以0.9%氯化鈉溶液作為空白對照溶液。

2.1.3 方法學考察

系統適用性試驗：分別取上述溶液各適量，按擬訂色譜條件進樣測定，記錄色譜圖，詳見圖1。理論板數以氨甲環酸峰計大于5 000，各成分基線分離良好，分離度大于1.5。

線性關系考察：稱取氨甲環酸對照品適量，精密稱定，加水溶解，制成質量濃度為8 g/L的對照品溶液，加水稀釋，制得質量濃度分別為 0.1，0.5，1.0，2.0，4.0 g/L的系列對照品溶液，按擬訂色譜條件進樣測定，記錄峰面積。以峰面積（Y）為縱坐標、氨甲環酸質量濃度（X）為橫坐標進行線性回歸，得回歸方程Y=429.44X+11.413，r=0.999 9（n=5）。結果表明，氨甲環酸質量濃度在0.1～8.0 g/L范圍內與峰面積線性關系良好。

圖1 高效液相色譜圖

精密度、穩定性、加樣回收試驗：按規定進行試驗，結果的RSD均小于1%，表明儀器精密度良好，供試品溶液在室溫放置24 h穩定，本方法重復性良好，平均加樣回收率為98.83%，RSD為2.35%（n=6）。

2.3 透皮試驗

2.3.1 豬皮樣品制備

將巴馬小型乳豬放血處死，觀察有無皮膚紅腫、充血、破損等現象。剃毛取腹部豬皮，除去皮下組織，用0.9%氯化鈉溶液洗凈，置-70℃冰箱中冷凍，備用[6]。

2.3.2 分組及試驗

取豬皮樣品，常溫解凍，切成所需小塊，用0.9%氯化鈉溶液洗凈，用濾紙吸干水分，稱定質量后攤平，表皮角質層向上。試驗分為3組，即實心微針組（A組）、空心微針組（B組）、空白對照組（C組）。A組用超納微晶美膚儀及其配套的方形實心微針，以2～3 N力垂直表面持續注入0.3 mL氨甲環酸注射液60 s。B組使用超納微晶美膚儀及其配套的方形空心微針，同法操作。C組不作任何處理。分別將3組豬皮固定在Franz擴散池，表皮角質層朝上，下表面接觸擴散池液面[7-8]。在接收池中加滿0.9%氯化鈉溶液37±0.1℃水浴加熱，定速磁力攪拌300±5 r/min平衡1 h，向供給室加入0.3 mL氨甲環酸注射液，用密封膠封口，以防溶劑蒸發。分別于0.5，1，2，4，8，12 h 時移取接收液 1.0 mL，經 0.22 μm微孔濾膜濾過，隨即補回1.0 mL備用接收液，測定含量，計算各時間點的藥物累積透過量并對時間進行回歸，所得斜率為透皮速率。詳見圖2和表1。透皮試驗12 h后拆除擴散池裝置，取出3組豬皮，剪取，用適量甲醇浸泡，超聲（功率為500 W，頻率為40 kHz）處理30 min，1 000 r/min離心15 min，補足減失的甲醇，搖勻，取適量，經0.22 μm微孔濾膜濾過，取續濾液，測定含量，并計算藥物滯留量。詳見表2。

圖2 不同微針作用于豬皮時藥物透皮吸收結果（n=6）

表1 藥物累積透過量回歸方程及透皮速率（n=6）

表2 3組藥物累積透過量與藥物滯留量（n=6）

結果顯示，透皮試驗0.5～2.0 h B組的藥物累積透過量明顯大于A組和C組，表明空心微針作用于豬皮可促進氨甲環酸的體外透皮作用。2.0 h后，3組藥物累積透過量隨時間延長而增大，表明兩種微針作用于豬皮均有利于氨甲環酸的透皮吸收。3組藥物累積透過量回歸方程均符合零級模型。0.5 h時，A組和B組藥物滯留量比C組分別提高了82.98%和162.07%；12 h時，各組藥物滯留量接近，A組和B組透皮速率比C組分別提高了21.20%和37.08%。

3 討論

本研究中選用與人體皮膚較接近的小型乳豬皮作為試驗屏障，預試驗中考察了腹部、背部和臀部豬皮的透皮吸收差異，發現腹部豬皮更適用于氨甲環酸透皮試驗。

氨甲環酸治療黃褐斑已逾30年，其在化學結構上與酪氨酸相似，均有1個羧基（-COOH），可與酪氨酸爭奪酪氨酸酶，進而干擾酪氨酸酶對酪氨酸的激活作用，從而減少黑色素合成[9]。

微針的主要作用為刺破皮膚表面的角質層以促進藥物滲透，本研究結果顯示，空心微針和實心微針均有利于氨甲環酸的透皮吸收，該結果可為下一步臨床研究提供依據。