曲格列酮對低氧狀態下肺動脈平滑肌細胞的作用機制研究*

楊中靜，皮衛峰，朱萍萍

（上海建工醫院呼吸科，上海 200083）

形成肺動脈高壓的機制非常復雜，其中低氧引起的肺血管收縮和肺血管重塑（PVR）是一個重要機制。低氧可導致肺動脈平滑肌細胞（PASMCs）過度增殖，從而導致PVR[1]。增殖體過氧化物酶激活受體γ（PPARγ）激動劑是一種平滑肌細胞生長的負性調節劑，在體內外均能抑制平滑肌細胞增殖。既往研究顯示，PPARγ激動劑在多種細胞內均能通過對抑癌基因PTEN的調節作用影響細胞的代謝、增殖和凋亡[2-4]，但對低氧狀態下的PASMCs能否通過調節PTEN發揮作用則尚未見報道。因此，本研究中觀察了PPARγ激動劑曲格列酮對低氧狀態下PASMCs的增殖、凋亡及PTEN/Akt表達的影響，并進一步通過PTEN抑制劑阻斷PTEN/Akt通路觀察對此作用的影響，以明確其是否通過調節PTEN發揮作用。現報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料與試藥

人 PASMCs及細胞培養液（美國 ScienCell實驗室）；逆轉錄試劑盒和聚合酶鏈反應（PCR）試劑盒（美國Fermentas公司）；CyQUANT細胞增殖檢測試劑盒（美國 Invitrogen公司）；小鼠抗 GAPDH、小鼠抗人PTEN（一抗）和羊抗小鼠IgG-HRP（二抗）（美國Santa Cruz公司）。

PTEN和GAPDH引物均由1st base公司（Singapore）合成，PTEN 上游序列：5′-tcaccaactgaagtggctaaaga-3′，下游序列：5′-ctccattcccctaacccga-3′，GAPDH 上游序列：5′-agccacatcgctcagacac-3′，下游序列：5′-taaaagcaggcctggtgac-3′。

曲格列酮（湖北巨勝科技有限公司，批號為20161009，規格為每瓶 10 mg）；GW9662（美國 Sigma 公司，批號為 011M4616V）；bpV（HOpic）（德國 Merck 公司，批號為 S865101）。

1.2 方法

分組：人PASMCs分別加入0.5～60 μmol/L的曲格列酮培養72 h，將培養的PASMCS分為正常對照組、模型組、曲格列酮（20μmol/L）組、曲格列酮（20μmol/L）+GW9662（1 μmol/L）組及曲格列酮（20 μmol/L）+bpV（HOpic，2.5 μmol/L）組。除正常對照組在常氧下培養，其余組均于1%氧體積分數、5%CO2條件下培養。

PASMCs增殖檢測：細胞培養48 h后使用細胞增殖檢測試劑盒檢測PASMCs增殖情況，操作步驟按照說明書進行。

定量PCR檢測：采用定量PCR法檢測基因的表達水平。使用25 μL的反應體系，定量PCR的循環數設定為40循環，初始變性10 min，隨后95℃變性15 s，退火30 s，72 ℃延伸 30 s。

Western blot檢測：使用PhosphoSafeTM蛋白提取試劑盒抽提細胞蛋白，Bradford法測定蛋白濃度，Western blot法檢測蛋白表達情況。

1.3 統計學處理

采用SPSS 19.0統計學軟件分析，計量資料以表示，行t檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

結果見圖1至圖4。曲格列酮在低氧濃度下培養細胞2，8，0.5 h時分別增加 PTEN mRNA 表達（3.2±0.5）倍，Caspase-3 mRNA 表達（3.1 ±0.6）倍，Caspase-8 mRNA（8.9 ±1.1）倍。低氧條件下，曲格列酮濃度為 20 μmol/L時，PASMCs內PTEN與p-Akt的mRNA和蛋白表達水平最高，而Akt無明顯變化，使用bpV（HOpic）和GW9662預處理后都能顯著抑制曲格列酮引起的PTEN蛋白表達水平升高，且能持續24 h。

3 討論

過氧化物酶增殖體激活受體（PPAR）屬核激素受體超家族，共有 PPARα，PPARγ，PPARδ 3 種亞型，其中PPARγ在調控細胞分化和調控多種代謝（糖、脂肪、能量代謝等）中起重要作用。PPARγ還能通過抑制TGF/smads信號途徑而抑制細胞因子和生長因子的信號傳導，發揮抑制血管平滑肌細胞增殖及遷移作用。PPARγ受體在正常肺組織中廣泛表達，而重度肺動脈高壓患者的肺血管中PPARγ基因及蛋白表達明顯降低[5]。對平滑肌細胞PPARγ基因敲除小鼠的研究表明，基因敲除的小鼠自發產生肺動脈高壓，引起右心室收縮壓上升，右心室的肥厚及遠端肺動脈的肌化[6]。

PTEN是PPARγ下游信號通路的一個重要因子。國外的研究表明，PTEN在肺動脈高壓發病機制中起了重要作用。在敲除小鼠血管平滑肌細胞的PTEN基因后，發現小鼠平滑肌細胞出現異常增殖，血管重構，以及與肺動脈高壓一致的組織病理改變[7]。而同時國內學者研究證實，PTEN/Akt的轉錄和激活與低氧導致的PASMCs增殖密切相關，并在低氧性肺動脈高壓形成過程中發揮重要作用[8]。大量研究表明，PPARγ在不同的細胞內對PTEN具有不同的調節作用，進而影響細胞的代謝、增殖和凋亡[9-12]。既往的研究同樣顯示，骨成形蛋白-2（BMP-2）能通過上調PTEN的表達抑制低氧狀態下PASMCs的增殖，且PPARγ拮抗劑能逆轉BMP-2的抑制增殖作用[13]，提示BMP-2通過PPARγ途徑發揮作用。

圖1 曲格列酮抑制低氧條件下PASMCs增殖情況（×100）

圖2 曲格列酮對低氧條件下相關蛋白表達的作用

圖3 曲格列酮對低氧條件下相關蛋白表達的作用（GW9662預處理）

圖4 曲格列酮對低氧條件下相關蛋白表達的作用[bpV（HOpic）預處理]

本研究結果顯示，PPARγ激動劑曲格列酮能抑制低氧條件下人PASMCs的增殖，上調PASMCs的PTEN基因及蛋白和p-Akt蛋白的表達；提示了PPARγ激動劑曲格列酮可能通過增加PTEN的表達，激活PI3K/Akt信號通路，抑制人PASMCs的水平，從而抑制慢性阻塞性肺疾病患者低氧狀態下的肺血管重塑。進一步驗證發現，PTEN抑制劑 bpV（HOpic）和 PPARγ拮抗劑GW9662均能逆轉曲格列酮的抑制低氧條件下人PASMCs增殖作用，并下調PASMCs的PTEN蛋白表達，進一步證明曲格列酮上調PTEN蛋白的表達是通過PPARγ信號通路途徑實現的，而其抑制PASMCs增殖的作用依賴于PPARγ-PTEN途徑。

Caspases家族在細胞凋亡中具有關鍵作用，又稱凋亡蛋白酶。Caspase-3為細胞凋亡的終末剪切酶，是誘導細胞凋亡的直接實施者，具有不可替代的地位。而Caspase-8是介導細胞凋亡的關鍵啟動因子，激活下一步級聯反應。檢測曲格列酮及低氧環境下Caspase-3和Caspase-8基因表達，結果提示，曲格列酮能增強Caspase-3和Caspase-8的活性，說明曲格列酮不僅可以直接抑制人PASMCs的增殖，還同時促進PASMCs的凋亡來抑制其低氧條件下的過度增殖，對抑制慢性阻塞性肺疾病等低氧狀態下的肺血管重塑具有重要意義。

綜上所述，曲格列酮以劑量依賴性方式通過PPARγ途徑增加PTEN的表達，促進低氧條件下PASMCs的凋亡。臨床上對于長期處于低氧狀態的人群如慢性阻塞性肺疾病患者，應用PPARγ激動劑可能通過抑制PASMCs的過度增殖顯著改善肺血管重塑狀況，預防或延緩肺動脈高壓、肺源性心臟病的發生，顯著改善慢性阻塞性肺疾病等低氧狀態患者的預后。而針對已發生低氧性肺動脈高壓的患者，PPARγ激動劑如曲格列酮可能同樣能顯著改善其病情，預防其進一步發展。本研究為體外試驗研究，證實了PPARγ作為低氧性肺動脈高壓的一個重要治療靶點[14-16]，可能通過多種機制發揮作用。但目前仍需進一步在體內試驗及大規模臨床試驗來進一步明確PPARγ激動劑在低氧狀態人群及肺動脈高壓患者中的作用特點及臨床療效。