皂角刺中總黃酮含量測定及其抗氧化活性研究*

宋忠興 ，唐志書 ，嚴邑萍 ，史鑫波 ，劉妍如 ，趙 鵬

（1.陜西興盛德藥業有限責任公司，陜西 銅川 727031； 2.陜西中醫藥大學·陜西省中藥資源產業化協同創新中心，陜西 咸陽 712046； 3.陜西中醫藥大學附屬醫院，陜西 咸陽 712000）

皂角刺又名皂莢刺、皂刺和天丁，為豆科植物皂莢Gleditsia sinensisLam.的干燥棘刺，始載于《本草衍義補遺》，具有消腫托毒、排膿、殺蟲、抗癌之功效，臨床常用于治療癰疽初起和膿成不潰[1]。皂角刺資源豐富，主產于我國河南、山東、陜西等地區。現代研究發現，皂角刺中含有黃酮類、萜類、甾體類、酚酸類等多種化學成分[2-3]，具有良好的抗腫瘤、抗菌、免疫調節等作用[4-5]，但其化學成分與含量測定方面的研究很少，中國藥典也未對其提取方法和含量測定進行規定。我國對皂角刺的研究主要在于化學成分和臨床藥理方面[6]，皂角刺中黃酮類成分為其抗腫瘤的主要活性成分，蘆丁則是其中的活性成分之一。為控制皂角刺質量及研究其活性，本試驗中以蘆丁為對照品，采用紫外-可見分光光度法，對皂角刺醇提物和水提物中總黃酮的含量進行測定[7-9]。同時，采用體外抗氧化方法對不同提取物進行評價，為合理開發皂角刺相關制劑及產品提供依據?，F報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

CPD225D型電子分析天平（賽多利斯科學儀器<北京>有限公司）；FW-1000AD型高速粉碎機（天津鑫博得儀器有限公司）；KQ-300DE型數控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；101-1型電熱鼓風干燥箱（北京科偉永興儀器有限公司）；UV-2600型紫外-可見分光光度計（日本島津公司）。

1.2 試藥

皂角刺所用藥材采自陜西，經陜西中醫藥大學白吉慶教授鑒定為豆科植物皂莢Gleditsia sinensisLam.的干燥棘刺，藥材標本存放于陜西中醫藥大學陜西省中藥資源產業化協同創新中心；蘆丁對照品（四川省維克奇生物科技有限公司，批號為wkq16101104，純度大于98%）；總抗氧化能力檢測試劑盒（上海碧云天生物技術有限公司，批號為S0116）；試驗用試劑均為分析純，水為純凈水。

2 方法與結果

2.1 原藥材前處理

將皂角刺藥材放入烘箱60℃干燥3 h，取200 g粉碎，過3號篩，得皂角刺粗粉。干燥至恒重，冷卻，備用。

2.2 提取方法

2.2.1 回流提取法[10]

皂角刺加熱回流醇提物：稱取5.0 g（平行3組）藥粉，精密稱定，過3號篩，置250 mL圓底燒瓶中，加入70%乙醇150 mL回流提取2 h，濾過，水浴蒸干，殘渣用50%乙醇溶解，溶液轉移至25 mL容量瓶中，經0.22 μm微孔濾膜濾過，取續濾液，作為供試品溶液。

皂角刺加熱回流水提物：操作同前，僅回流時所加液體由70%乙醇換為水。

2.2.2 超聲提取法[11]

皂角刺超聲醇提物：稱取5.0 g（平行3組）藥粉，精密稱定，過3號篩，置具塞錐形瓶中，加70%乙醇75 mL，超聲（功率為250 W，頻率為40 kHz，下同）處理30 min，濾過，殘渣加70%乙醇75 mL，超聲處理30 min，合并濾液，濾液水浴蒸干，殘渣溶于50%乙醇，將溶液轉移至25 mL容量瓶中，經0.22 μm微孔濾膜濾過，取續濾液，作為供試品溶液。

皂角刺超聲水提物：操作同前，僅超聲時所加液體由70%乙醇換為水。

2.3 總黃酮含量測定

2.3.1 對照品溶液制備

取120℃干燥至恒重的蘆丁對照品5.5 mg，精密稱定，置25 mL容量瓶中，加50%乙醇10 mL，超聲溶解，加50%乙醇定容，搖勻，得質量濃度為0.22 g/L的對照品溶液。

2.3.2 最大吸收波長選擇

精密量取對照品溶液3 mL，置10 mL具塞試管中，加5%亞硝酸鈉溶液 0.3 mL，搖勻，靜置 6 min，加入10%硝酸鋁溶液0.3 mL，搖勻，靜置6 min，加入1 mol/L氫氧化鈉溶液4mL，用50%乙醇定容，搖勻，靜置15 min。置比色皿中，參照空白試劑，并在200～800 nm波長范圍內掃描。結果表明，蘆丁在510 nm波長處有最大吸收，故選定檢測波長為510 nm[7]。

2.3.3 方法學考察

線性關系考察：精密吸取對照品溶液 0，0.25，0.50，1.00，2.00，3.00，4.00 mL，其余操作同 2.3.2 項下“置比色皿中”前，以第一份作為空白對照，于510 nm波長處測定吸光度[7]。以吸光度（Y）為縱坐標、蘆丁質量濃度（X）為橫坐標進行線性回歸，得回歸方程Y=13.912X-0.007 1，r=0.999 8（n=7）。結 果表明，蘆丁質量濃度在0.005 5～0.088 0 g/L范圍內與吸光度線性關系良好。

精密度試驗：日內精密度，取皂角刺加熱回流水提物供試品溶液適量，按2.3.2項下方法操作，1 d內連續測定6次，測得吸光度的RSD為1.47%（n=6）；日間精密度，取皂角刺加熱回流水提物供試品溶液適量，按2.3.2項下方法操作，連續測定3 d，測得吸光度的RSD為0.96%（n=3）。結果表明，儀器精密度良好。

穩定性試驗：精密吸取皂角刺加熱回流水提物供試品溶液適量，于室溫下分別放置 0，10，20，30，40 min 時測定吸光度。結果的RSD為2.00%（n=5），表明室溫下供試品溶液在40 min內穩定。

重復性試驗：另取同一批皂角刺藥材粉末6份，每份約5 g，按2.2項下回流水提物方法提取，依法測定。結果的RSD為1.33%（n=6），表明方法重復性良好。

加樣回收試驗：稱取已知含量的皂角刺樣品6份，精密稱定，均分為3組，分別按樣品中黃酮含量80%，100%，120%的比例加入蘆丁對照品溶液，依法進行樣品制備及含量測定，并計算加樣回收率。結果見表1。

表1 蘆丁加樣回收試驗結果（n=6）

2.3.4 樣品含量測定

稱取皂角刺藥材粉末約5 g，精密稱定，依法進行樣品制備及含量測定。結果不同提取物中總黃酮的含量有一定差異，總黃酮含量排序依次為超聲醇提物（1.38%）>回流醇提物（1.35%）>回流水提物（0.76%）>超聲水提物（0.33%），故可選擇總黃酮含量最高的超聲醇提法提取皂角刺總黃酮。

2.4 皂角刺總黃酮抗氧化活性測定

2.4.1 溶液制備

標準品溶液：取27.8 mg總抗氧化能力（T-AOC）測試盒中的FeSO4-7H2O適量，以水溶解并定容至1 mL，此時濃度為 100 mol/L，以水稀釋至 0.15，0.30，0.60，0.90，1.20，1.50 mmol/L。

FRAP工作液：按試劑盒中的試劑一∶試劑二∶試劑三（10 ∶1 ∶1，V/V/V）混勻充分，避光 37 ℃孵育，現用現配，2 h內用完。

2.4.2 清除Fe3+活性測定

在96孔板中分別標定空白孔、標準孔、測定孔，加相應溶液各5 μL，再分別加入FRAP工作液180 μL。37℃下孵育3～5 min，檢測波長為593 nm，記錄吸光度。空白孔測定1次，測定孔和標準孔分別作3組對照，每組測3次。以標準品吸光度（Y）為縱坐標、標準品質量濃度（X）為橫坐標進行線性回歸，得回歸方程Y=0.275 4X+0.050 4（r=0.999 7）。按上述方程測定不同質量濃度樣品吸光度，結果見表2。將上述各提取物樣本測得的吸光度代入線性方程，計算總抗氧化能力。

表2 不同質量濃度樣品吸光度

水提物和醇提物對Fe3+的清除作用分析結果見圖1。可見，皂角刺加熱回流水提物對Fe3+的清除作用較強，即總抗氧化能力最強。在總黃酮質量濃度為0.1～0.3 g/L范圍內，不同提取物還原能力與濃度呈正相關。不同提取物皂角刺總黃酮對Fe3+的還原能力排序為回流水提物>超聲水提物>回流醇提物>超聲醇提物。

圖1 不同提取物的總抗氧化能力趨勢圖

3 討論

黃酮類化合物廣泛存在于自然界各類植物中，具有多種生物活性[12]，為中藥重要的化學成分。目前測定總黃酮的方法以紫外-可見分光光度法和高效液相色譜（HPLC）法多見，本研究中采用紫外-可見分光光度法測定皂角刺中總黃酮含量，方法準確、簡單、可靠，可作為皂角刺藥材中總黃酮含量的檢測方法。回流醇提物和超聲醇提物中總黃酮含量明顯高于相應水提物。因此，建議在研究以黃酮為藥效物質基礎時，可以醇提物為主。

本研究結果顯示，不同方法和溶劑提取的皂角刺中總黃酮的含量差異明顯，但均有一定的抗氧化能力。FRAP為Fe3+還原抗氧化體系衡量總抗氧化能力指標[13]，目前鮮有皂角刺總黃酮的體外抗氧化研究報道，但實驗研究發現，不同提取物對Fe3+的還原能力與其總黃酮的含量并無量效關系。同時，水提物的抗氧化能力均大于醇提物，表明皂角刺的抗氧化能力與提取溶劑和總黃酮含量均相關，初步推測其抗氧化作用也可能與來自總黃酮中具體的黃酮種類有關，但要確定總黃酮物質中哪種成分起到了抗氧化作用，還需要進一步深入研究。相關研究顯示，其抗氧化活性物質可能是總黃酮、酚酸類和萜類等?；亓魉嵛锏目寡趸钚宰詈?，可將其作為下一步的研究重點。目前已開展皂角刺中酚酸類和萜類等成分生物活性效應評價[14]，以期早日將其應用于臨床[15]。