新疆帕金森病患者PARK18基因rs3129882位點多態性與免疫球蛋白的相關性

喬 蕊,徐澤恒,孟新玲,夏 歡,楊新玲*

(1新疆醫科大學第二附屬醫院神經內科,烏魯木齊 830063;2新疆醫科大學附屬中醫院腦病一科;3新疆醫科大學第三附屬醫院核醫學科;*通訊作者,E-mail:poplar862@sohu.com)

帕金森病(Parkinson’s disease,PD)是第二常見且和年齡密切相關的神經系統變性疾病。全球有數百萬人患病,60歲以上的人大約有1%的人受到該病的影響[1]。其中散發型帕金森病(sporadic Parkinson’s disease,SPD)占絕大多數,約占90%左右。近年來在PD患者腦組織活檢中發現了活化的小膠質細胞、人類白細胞抗原(HLA)表達上調及炎性物質的增高等,均提示免疫炎癥機制參與了PD的發病過程[2-5]。相關研究報道PARK18基因rs3129882是SPD的風險基因,其所在的HLA Ⅱ區單核苷酸多態性(single nuclear polymorphism,SNP)高度可變,存在民族及地區的差異[6-10]。rs3129882是PARK18基因的1號內含子,參與基因的表達調控,并且相關研究發現rs3129882作為順式元件參與PARK18基因剪接,影響PARK18基因編碼的蛋白形成及其抗原呈遞從而參與帕金森病的發生[11]。免疫球蛋白的合成受遺傳基因的調控,故基因的多態性可能影響免疫球蛋白的生成。故本課題組將研究PARK18基因rs3129882位點多態性與新疆地區SPD發病及免疫球蛋白水平的相關性。

1 對象及方法

1.1 研究對象

選取就診于新疆醫科大學第一附屬醫院、第二附屬醫院及附屬中醫院神經內科門診及病房符合帕金森病診斷標準[12,13]的SPD患者193例,其中漢族SPD患者112例,維吾爾族SPD患者81例,男性SPD患者100例,女性SPD患者93例,平均年齡為(59.82±5.27)歲。同時選取體檢中心進行體檢的健康體檢者232例作為對照組,其中漢族128例,維吾爾族104例,男性121例,女性111例,平均年齡為(59.69±5.12)歲。對照組與病例組在年齡、性別、民族方面比較差異無統計學意義(P>0.05)。所有研究對象均簽署知情同意書。

排除標準:①排除發熱和血常規異常的感染者;②排除患有免疫系統疾病者;③排除近1個月內使用抗生素、激素和(或)應用非甾體類抗炎藥及免疫抑制劑者;④排除近期外傷及手術的患者;⑤排除肝腎功能異常者、嚴重心臟疾病者及在3個月內接受過疫苗注射者;⑥排除惡性腫瘤或患有變性疾病者。

1.2 方法

1.2.1 DNA的制備及引物的設計、合成 抽取2 ml外周靜脈血置于抗凝管中,使用北京天根生化科技有限公司的血液基因組DNA提取試劑盒,按照試劑盒配套說明操作書提取基因組DNA。在紫外線分光光度計上,以稀釋DNA的緩沖液為對照測定基因組DNA在260 nm和280 nm處的吸光度(A)值,A260/A280為1.7-1.9,判為DNA純度合格。樣本-20 ℃保存,備用。引物設計參照文獻[14]由上海生工公司合成。PARK18基因rs3129882位點:上游引物:5′-GAAGCAGGGGGACTATGACG-3′。下游引物:5′-TTATGTAGCCCTGCTGTGGT-3′。

1.2.2 目的基因PCR及測序 反應體系共30 μl：10×PCR Buffer(Mg2+plus)3 μl,dNTP Mixture(2.5 mmol/L)3 μl,上下游引物(5 μmol/L)各1.5 μl,TaKaRa TaqTMPolymerase(5 U/ml)0.3 μl,DNA模板1 μl,加水補至30 μl。整個PCR擴增反應在Verity 96well PCR儀(美國ABI公司)中進行。反應條件:95 ℃ 5 min;15個循環×(95 ℃ 30 s,65-50 ℃(-1 ℃/循環)30 s,72 ℃ 60 s);20個循環×(95 ℃ 30 s,退火溫度52 ℃ 30 s,72 ℃ 60 s);4 ℃保存,PCR產物為232 bp。所得PCR產物加樣10 μl于2%瓊脂糖凝膠中,以120 V電泳40 min,于紫外線凝膠成像儀下觀察,確定所得產物為研究所需片段。取10 μl PCR擴增產物送上海生工生物公司直接測序以確定DNA序列。PARK18基因rs3129882位點分析結果與既往國內外相同研究一致,SPD組及對照組均存在AA、AG、GG三種基因型。

1.2.3 血清免疫球蛋白的檢測 取清晨空腹靜脈血2 ml置于真空促凝管,2 h內,4 ℃、4 000 r/min,離心5 min,取血清。使用美國貝克曼庫爾特特種蛋白分析儀采用免疫比濁法檢測血清中IgG、IgA、IgM水平,機器型號:IMMAGE800,試劑盒:美國貝克曼庫爾特免疫球蛋白G檢測試劑盒、免疫球蛋白A檢測試劑盒、免疫球蛋白M檢測試劑盒。

2 結果

2.1 Hardy-Weinberg平衡定律吻合度檢驗

病例組(P=0.358)和對照組(P=0.564)的基因型分布均符合Hardy-Weinberg遺傳平衡定律(P>0.05),表示兩組均有良好的群體代表性。

2.2 部分測序峰圖

病例組和對照組rs3129882位點測序均發現存在AA型(野生型)、AG型(雜合突變型)、GG型(純合突變型)三種基因型(見圖1)。

2.3 兩組rs3129882基因型和等位基因分布的比較

病例組與對照組PARK18基因rs3129882基因型和等位基因分布的比較,差異無統計學意義(P>0.05,見表1)。

圖1 rs3129882位點測序圖Figure 1 Sequencing of rs3129882 site

表1SPD組與對照組rs3129882基因型和等位基因頻率分布比較例(%)

Table1Comparisonofrs3129882genotypeandallelefrequenciesindifferentgroupscases(%)

組別n基因型頻率GGAGAAχ2P等位基因頻率GAχ2P病例組19377(39.9)85(44.0)31(16.1)0.1280.938239(61.9)147(38.1)0.0450.832對照組23289(38.4)106(45.7)37(15.9)284(61.2)180(38.8)

2.4 不同分層rs3129882基因型頻率及等位基因比較

按民族分層分析,維吾爾族SPD病例組和對照組rs3129882基因型頻率比較差異無統計學意義(χ2=0.942,P=0.624),等位基因分布比較差異無統計學意義(χ2=0.017,P=0.895);漢族SPD病例組和對照組rs3129882基因型頻率比較差異無統計學意義(χ2=0.242,P=0.886),等位基因分布比較差異無統計學意義(χ2=0.027,P=0.870)。按性別分層分析,男性SPD病例組和對照組rs3129882基因型頻率比較差異無統計學意義(χ2=0.269,P=0.874),等位基因分布比較差異無統計學意義(χ2=0.158,P=0.691);女性SPD病例組和對照組rs3129882基因型頻率比較差異無統計學意義(χ2=0.590,P=0.745),等位基因分布比較差異無統計學意義(χ2=2.118,P=0.146)。

2.5 三種基因型間IgG、IgA、IgM比較

對于SPD病例組,三種基因型間IgG(F=0.533,P=0.588)、IgA(F=1.299,P=0.275)、IgM(F=0.799,P=0.451)含量比較差異無統計學意義;對于對照組,三種基因型間IgG(F=0.341,P=0.712)、IgA(F=0.449,P=0.639)、IgM(F=0.727,P=0.484)含量比較差異無統計學意義。

2.6 不同分層三種基因型間IgG、IgA、IgM比較

按民族分層分析,對于SPD病例組,漢族和維吾爾族三種基因型間IgG、IgA、IgM含量比較差異無統計學意義(P>0.05,見表2);對于對照組,漢族和維吾爾族三種基因間IgG、IgA、IgM含量比較差異無統計學意義(P>0.05,見表2)。

分組民族基因型nIgGIgAIgM病例組漢族GG4410.55±1.602.49±0.760.79±0.18AG5110.45±1.742.71±0.690.80±0.17AA1711.00±0.962.40±0.780.83±0.20F0.7671.6020.329P0.4670.2060.720維吾爾族GG3311.69±0.962.59±0.531.24±0.62AG3411.87±0.942.41±0.481.11±0.43AA1411.73±1.202.33±0.251.25±0.60F0.2961.9840.590P0.7450.1440.557對照組漢族GG51 9.78±1.502.63±0.850.91±0.45AG55 9.53±2.092.59±0.780.99±0.56AA22 9.86±1.492.76±0.901.02±0.46F0.3980.3110.499P0.6730.7330.608維吾爾族GG3810.72±1.801.89±0.741.35±0.77AG5110.52±1.481.79±0.791.44±0.61AA1510.08±1.901.70±0.681.30±0.71F0.7930.4070.321P0.4550.6670.726

按性別分層分析,對于SPD病例組,男性和女性三種基因間IgG、IgA、IgM含量比較差異均無統計學意義(P>0.05,見表3);對于對照組,男性和女性三種基因型間IgG、IgA、IgM含量比較差異無統計學意義(P>0.05,見表3)。

分組性別基因型nIgGIgAIgM病例組男GG4011.14±1.292.46±0.570.91±0.39AG4611.15±1.712.58±0.660.95±0.34AA1411.06±0.932.42±0.590.97±0.39F0.0220.6180.185P0.9790.5410.831女GG3710.94±1.662.62±0.771.06±0.56AG3910.87±1.522.59±0.600.89±0.34AA1711.56±1.232.33±0.621.06±0.53F1.2861.1251.563P0.2820.3290.215對照組男GG4710.15±1.822.35±0.880.99±0.50AG5410.21±1.942.25±0.931.22±0.60AA2010.03±1.692.43±1.091.10±0.50F0.0710.3152.099P0.9310.7300.127女GG4210.22±1.56 2.28±0.891.22±0.76AG529.79±1.812.16±0.821.20±0.66AA179.85±1.642.20±0.811.18±0.68F0.7990.2180.021P0.4530.8040.979

3 討論

PD最早是在1817年由Parkinson醫生提出的,臨床上主要以靜止性震顫、肌肉僵直、運動弛緩的典型運動癥狀為主。盡管從PD第一次被提出到現在已200余年,但目前該病的病因及發病機制尚不明確,除此之外疾病的診斷及治療也十分有限。因此亟需加深對疾病的研究,明確病因、機制,找到有效的診斷及治療方法。免疫機制和PD的關系是由Abramsky等[15]首先提出的,近年來越來越多的研究成果也證實了這個觀點。探討PARK18基因rs3129882位點多態性與新疆SPD及免疫球蛋白的關系,這對SPD的早期診斷、治療具有重要的臨床價值。

3.1 兩組研究對象PARK18基因rs3129882位點多態性比較

在最近的全基因組關聯研究(genome-wide association study,GWAS)中PARK18基因被定義為散發型帕金森病的風險基因[14]。rs3129882被認為是與PD相關性最強的非編碼多態性位點,其通過免疫機制增加了SPD發生的風險。PARK18基因rs3129882位點多態性與SPD的關系最早是在白種人中發現的[14],在該項研究中作者發現rs3129882(A/G)的G等位基因與美國人患帕金森病的風險增加有關,并強調了該位點與帕金森病及人類免疫的關系。Jamshidi等[16]研究發現rs3129882的等位基因頻率在伊朗帕金森病患者和對照組之間存在顯著的差異,從而推測出rs3129882的多態性可能是伊朗人PD的一個風險因素。田錦勇[17]通過對中國漢族SPD患者及對照組的PARK16-18基因位點進行分析,發現rs3129882位點所有基因型中,SPD組A等位基因頻率高于對照組,且差異有統計學意義,另外對該位點基因型按年齡和性別進行分層分析時發現AA基因型多見于男性,且具有統計學意義。但Ma等[18]在包括中國、新加坡和馬來西亞在內的帕金森病病例對照研究的薈萃分析中發現rs3129882等位基因型分布在病例組與對照組之間沒有顯著差異,從而推測出PARK18基因rs3129882 A/G多態性和中國帕金森病患者無關,這和本文研究結果一致。近年來有關PARK18基因rs3129882位點多態性與SPD關系的研究逐年增加,但結果不盡相同,可能與PARK18基因rs3129882是一組免疫應答基因,具有高度多態性,存在民族及地區差異有關。此外SPD的發生不是單一因素的作用而是包括基因-環境因素在內多種因素共同作用的結果。本文研究結果暫不能證明PARK18基因rs3129882位點多態性與新疆地區SPD患者發病相關,除了上述提到的兩種因素外,還可能與樣本量相對不足有關,但不能就此排除該基因多態性參與SPD發病可能。因此PARK18基因rs3129882位點多態性在不同地區、不同人群中是否為SPD發病的危險因素還需深入研究。

3.2 PARK18基因rs3129882位點多態性和免疫球蛋白之間的關系

不同的抗原分子的特殊表位被不同的HLA Ⅱ類基因產物識別,進而刺激機體產生不同免疫應答。HLA特殊類型的存在可能使機體對某些抗原產生高免疫球蛋白[19,20]。免疫球蛋白的合成受遺傳基因的控制,故PARK18基因rs3129882位點多態性可能使機體對某些抗原產生過高的免疫球蛋白。謝慶玲等[21]通過分析HLA基因多態性與支氣管哮喘兒童IgE水平關系的研究發現HLA-DRB1*160XX和HLA-DRB1*3(17)等位基因與哮喘兒童的血清IgE水平相關,且HLA-DRB1*160XX可能是高水平血清IgE的抗性基因。季偉等[22]研究發現毛細支氣管炎患兒外周血淋巴細胞HLA-DR表達陽性率顯著高于對照組,并與血清IgE水平呈顯著的正相關。于立杰等[23]研究發現HLA-DRB1*03基因與IgG4相關疾病易感有關。除此之外,其他疾病如浸潤型肺結核、Graves眼病、慢性蕁麻疹等研究證實了HLA Ⅱ類基因多態性與免疫球蛋白之間有一定的相關性。本研究結果表明SPD患者PARK18基因rs3129882位點多態性和IgG、IgA、IgM水平無關,但因目前國內外尚無相關研究涉及PARK18基因rs3129882位點多態性與免疫球蛋白之間的關系,故需反復研究明確兩者之間的關系。