長鏈非編碼RNA DANCR在神經膠質瘤中的表達水平和臨床意義

杜金龍

(咸寧市中心醫院,湖北科技學院附屬第一醫院重癥醫學科,咸寧 437100)

神經膠質瘤是惡性程度最高的中樞神經系統原發腫瘤,約占顱內腫瘤的46%,因其病程短,易復發,故徹底治療較為困難[1,2]。雖然目前已經有手術切除治療、放療化療、神經導航等治療方式,但因瘤體增殖迅速、瘤細胞呈浸潤性生長、腫瘤組織有較高的侵襲能力且與正常組織界限不清,故關于膠質瘤的治療效果并不理想[3,4]。腫瘤的病變位置復雜,病人術后復發率較高,患者預后較差[5-7]。

長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA,lncRNA)是一類堿基長度大于200 bp的RNA,之前被認為是RNA轉錄中的副產物,不具有生物學活性[8]。但是近些年來的研究發現,在某些腫瘤組織中,一些lncRNA的表達水平會出現異常,這些異常表達的lncRNA可影響細胞的一些重要的生物學過程如轉錄、增殖、凋亡以及分化等,這提示這些RNA可能可以作為早期診斷腫瘤的潛在生物標志物以及治療靶點[9-11]。先前的研究證實,lncRNA-DANCR的表達可能在胃癌[12]、成視網膜細胞瘤[13]、神經膠質瘤[14]等腫瘤的發生和發展過程中發揮關鍵作用。但是目前,關于DANCR在腦神經膠質瘤中的表達情況以及與患者臨床病理特征的相關性仍無明確研究結果。因此本研究通過檢測DANCR在不同級別膠質瘤組織和正常腦組織中的不同表達情況,分析其與膠質瘤患者各臨床病理特征的相關程度以及與患者術后預后的關系,明確其臨床意義,探討其作為早期預測膠質瘤的生物學標記物的可能性。

1 材料與方法

1.1 研究對象

本研究統計了咸寧市中心醫院自2013-01～2018-01收治的52例神經膠質瘤患者手術切除的腫瘤組織標本以及患者的臨床相關病理資料,入選患者術前均未接受放化療或者其他抗癌治療,所有病例均為首次手術治療并且具有連續5年內同步更新的隨訪資料。其中所選病例有男性30例,女性22例,年齡在26-77歲范圍內,平均年齡為56歲。此外統計了患者的腫瘤大小、腫瘤數目、KPS評分以及是否發生復發情況。按照WHO(2007年)神經系統腫瘤分類的標準對以上腫瘤組織進行組織學分級:Ⅰ級8例,Ⅱ級12例,Ⅲ級20例,Ⅳ級12例。此外有23例正常腦組織標本取自因顱腦損傷進行顱內減壓術的患者。從手術之日起每3個月對該膠質瘤患者進行一次預后隨訪。隨訪方式為入院復查或者電話通話等,患者隨訪資料進行同步更新,隨訪截止日期為2018年1月。本研究被咸寧市中心醫院倫理委員會準許,所有患者術前均簽署知情同意書。

1.2 實驗方法

將收集的膠質瘤組織標本和正常腦組織標本首先進行脫蠟處理,接著采用Trizol法提取組織標本中的總RNA(Invitrogen,CA,USA),然后采用紫外分光光度計測定組織標本在波長為260 nm以及280 nm處的吸光度比值,并計算OD260/OD280,選擇OD比值在1.8-2.1范圍內的總RNA作為樣本。將RNA樣品逆轉錄為cDNA后應用RT-PCR法分別檢測神經膠質瘤組織和正常腦組織標本中DANCR的表達水平,內參設置為GAPDH。引物序列如下:DANCR上游引物正向:5′-GCCACTATGTAG-AGGGTTTC-3′;下游引物反向:5′-ACCTGCGCTAAGAACTGAGG-3′。GAPDH上游引物正向:5′-AGAAGGCTGGGGCTCATTTG-3′;下游引物反向:5′-AGGGGCCATCCACAGTCTTC-3′。采用2-ΔΔCt法對測得的數據進行相對定量分析,所有實驗至少重復3次。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 神經膠質瘤組織中DANCR表達水平明顯增高

RT-PCR的實驗檢測結果顯示,與正常腦組織相比,神經膠質瘤組織中DANCR的表達水平明顯增高(1.00±0.22vs3.06±0.28,P<0.001)。同時級別高(Ⅲ-Ⅳ級)的膠質瘤患者組織中的DANCR的表達水平(3.71±0.40)明顯高于級別低(Ⅰ-Ⅱ級)的膠質瘤組織(2.41±0.22),這提示DANCR的表達水平與腫瘤惡性程度呈正相關(P=0.013,見圖1)。

2.2 DANCR表達水平與膠質瘤患者臨床病理指標的相關性

以DANCR在所有膠質瘤病理組織樣本中平均表達水平(3.06±0.28)為界,將入選患者分為DANCR低表達組(21例,DANCR表達水平低于平均值)和DANCR高表達組(31例,DANCR表達水平高于平均值)。然后分析DANCR的表達水平與臨床病理指標的相關性,結果顯示:神經膠質瘤組織中高表達水平的DANCR與高病理分級(P<0.001)、低KPS評分(P=0.001)以及患者術后復發(P=0.004)有密切關系,而與患者的年齡(P=0.695)、性別(P=0.947)、腫瘤大小(P=0.523)以及腫瘤數目(P=0.463)等均無關(見表1)。

2.3 DANCR的表達水平與膠質瘤患者臨床預后的關系

用Kaplan-Meier繪制DANCR低表達組和高表達組的患者術后5年生存率曲線并進行Log-rank檢驗,結果顯示,神經膠質瘤組織中DANCR高表達組的患者預后和低表達組相比明顯較差,患者術后5年生存期大大縮短,差異具有統計學意義(P=0.012,見圖2)。

與正常腦組織比較,***P<0.001 與Ⅰ-Ⅱ級比較，**P<0.01 A.神經膠質瘤組織中DANCR的表達 B.不同級別膠質瘤患者組織中的DANCR的表達圖1 LncRNA-DANCR在正常腦組織和神經膠質瘤組織中的表達水平Figure 1 Expression levels of lncRNA-DANCR in normal brain tissues and glioma tissues

表1lncRNA-DANCR表達水平與膠質瘤患者臨床病理指標的相關性

Table1CorrelationbetweenlncRNA-DANCRexpressionlevelsandclinicopathologicalcharacteristicsofgliomapatients

臨床特征分層亞組nDANCR低表達(n=21)DANCR高表達(n=31)χ2P年齡0.1540.695 <50歲281216 ≥50歲24915性別0.0040.947 男301218 女22913病理分級21.185<0.001 Ⅰ-Ⅱ級20164 Ⅲ-Ⅳ級32527KPS評分10.5640.002 ≥80分23158 <80分29623術后復發8.1790.008 是32824 否20137腫瘤直徑0.4070.523 <4 cm221012 ≥4 cm301119腫瘤個數0.5380.573 單個291316 多個23815

圖2 lncRNA-DANCR高表達組和低表達組患者術后生存率的比較Figure 2 Comparison of postoperative survival rates of patients between lncRNA-DANCR high-expression group and low-expression group

表2膠質瘤患者不同臨床病理因素與生存率的單因素分析結果

Table2Univariateanalysisofdifferentclinicopathologicalfactorsandsurvivalratesingliomapatients

臨床病理特征HR(95% CI)P年齡(<50歲 vs ≥50歲)1.231(0.694-2.146)0.405性別(男vs女)1.092(0.601-1.857)0.572KPS評分(<80 vs ≥80)2.105(1.241-3.922)0.019病理分級(Ⅰ-Ⅱ級vsⅢ-Ⅳ級)1.984(1.187-3.568)0.022術后復發(是vs否)2.463(1.445-4.525)0.010腫瘤大小(<4 cm vs ≥4 cm)1.484(0.804-2.627)0.283腫瘤數目(單個vs多個)1.129(0.646-1.921)0.502DANCR表達水平(低vs高)2.734(1.526-5.171)0.002

將各患者臨床病理指標與生存率進行了單因素分析,結果見表2。而后將單因素分析中具有統計學意義的病理指標進行多因素COX比例風險回歸分析。分析結果顯示:高表達水平的DANCR、高病理級別、KPS評分<80分以及術后復發均為影響膠質瘤患者臨床預后的獨立危險因素(見表3)。

表3膠質瘤患者不同臨床病理因素與生存率的多因素分析結果

Table3MultivariateCoxregressionanalysisofdifferentclinicopathologicalfactorsandsurvivalratesingliomapatients

臨床病理特征HR(95% CI)PKPS評分(<80 vs ≥80)2.421(1.417-4.439)0.011病理分級(Ⅰ-Ⅱ級vsⅢ-Ⅳ級)2.259(1.384-4.151)0.017術后復發(是vs否)2.815(1.762-5.322)0.001DANCR表達水平(低vs高)2.982(1.829-5.507)<0.001

3 討論

神經膠質瘤是一種常見的惡性程度最高的中樞神經系統原發腫瘤,具有極強的侵襲性和無限增殖的特點,并且在組織中呈浸潤性生長。與正常組織之間的界限不清楚使得手術中很難將其完全切除,繼而殘留的腫瘤細胞會再次增殖,導致患者術后極易復發,臨床預后較差[15]。目前,在有關神經膠質瘤的臨床診療中仍然缺少可靠的可預測膠質瘤患者預后的生物學標志物。雖然大量的研究已經證實膠質瘤患者的預后與WHO分級、KPS評分等因素有關,但是由于患者自身的差異性和腫瘤的復雜性,這些因素并不能達到精確評估的要求[16,17]。因此本課題組進行了一系列相關研究,目的在于尋找一種可提前診斷膠質瘤并且可以準確預測膠質瘤患者術后預后的生物學標志物,從而為神經膠質瘤的早期診斷、臨床治療以及判斷預后提供實驗證實和新手段。

近些年來,越來越多的研究發現,在某些腫瘤組織中,lncRNA的表達水平會出現異常,而這些異常表達的lncRNA可影響腫瘤細胞發生發展過程中多個關鍵環節[18]。同時有研究證實,lncRNA與細胞生物學特征密切相關,可通過調節信號傳導通路促進細胞癌變并影響腫瘤細胞的增殖、遷移以及侵襲能力等,這提示其可能作為腫瘤發生潛在的生物學標志物以及治療靶點[19]。例如,Zhao等[20]的研究發現lncRNA-HOTAIR在乳腺癌中作為促癌基因,其表達水平在乳腺癌組織和細胞中顯著升高,抑制癌細胞中lncRNA-HOTAIR的表達,可通過調節microRNA-20a-5p/HMGA2通路,明顯抑制細胞的增殖、遷移和侵襲能力,并且促進腫瘤細胞的凋亡。Yang等[21]證實lncRNA-MAGI2-AS3在乳腺癌中作為抑癌基因,其表達水平在乳腺癌組織中顯著降低,可明顯抑制腫瘤細胞的增殖能力。DANCR(differentiation antagonizing non-coding RNA,反分化長鏈非編碼RNA)作為lncRNA家族中的一員,已被證實在多種類型的惡性腫瘤發生發展過程中發揮重要的調節作用。例如,有研究報道,DANCR在非小細胞性肺癌組織和細胞中的表達顯著升高,DANCR可促進癌細胞的增殖、遷移和侵襲能力[22]。也有研究證實其在膠質瘤中的調節作用,Li等[23]證實,DANCR在膠質瘤組織和細胞中的表達水平呈異常升高趨勢,過表達的DANCR可通過激活Wnt/β-catenin信號通路,促進膠質瘤的惡性進展。然而,DANCR在預測膠質瘤患者臨床預后的作用卻沒有研究報道。因此,本研究探討了不同表達水平的DANCR與膠質瘤患者的臨床病理特征以及預后之間的相關性。

在研究中,我們首先應用RT-PCR技術檢測了DANCR在神經膠質瘤組織和正常腦組織中的表達水平,分析統計結果,我們發現在神經膠質瘤組織中DANCR的表達水平明顯低于正常腦組織,且表達量隨著膠質瘤惡性程度的升高而增高。然后,我們進一步分析了DANCR的表達水平與神經膠質瘤患者各臨床病理指標的相關性,結果顯示:神經膠質瘤組織中高表達水平的DANCR與腫瘤的高病理分級、低KPS評分以及患者術后復發有密切關系,而與患者的年齡、性別、腫瘤大小以及腫瘤數目等均無關。最后,我們探討了DANCR的表達水平以及病理分級、KPS評分等因素與膠質瘤患者臨床預后的關系。根據我們同步更新的隨訪數據可知,DANCR高表達組患者的術后5年生存率明顯低于DANCR低表達組。同時我們的研究證實高表達水平的DANCR、高病理級別、KPS評分<80分以及術后復發均與膠質瘤患者臨床預后情況密切相關,都可作為預測患者預后的指標。

綜上所述,本研究中我們證實了DANCR在神經膠質瘤組織中的表達水平顯著增高,而高表達水平的DANCR與膠質瘤患者的不良臨床預后有關,可作為預測膠質瘤患者術后預后的獨立因素。然而DANCR在神經膠質瘤發生發展過程中的具體作用機制,以及可能涉及到的更多靶基因和信號傳導通路目前尚不能得出結論,這將是我們團隊下一步的研究方向和重點。