GDF15和MMP7的表達與胃癌臨床病理特征及其預后的相關性

郭小剛,李 東,黃自鐸

(重慶市黔江中心醫院普外科,重慶 409000;*通訊作者,E-mail:limao1816@sina.com)

胃癌是常見的消化系統惡性腫瘤,我國胃癌死亡率占全部惡性腫瘤的23.2%,位于惡性腫瘤死亡率的第一位[1,2]。MMP7又稱基質溶解素(matrilysin),基因定位于11號染色體q21-q22上,編碼267個氨基酸,是基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase,MMPs)家族成員之一[3]。MMP7蛋白有基質降解活性和底物特異性,能夠特異性降解細胞外基質和基底膜成分,對細胞生長、分化和凋亡等具有調控作用[4]。MMP7過表達加速胃癌細胞的浸潤和轉移[5]。生長分化因子15(growth differentiation factor 15,GDF15),又稱前列腺衍生因子(prostate-derived factor,PDF),是轉化生長因子(transforming growth factor,TGF-β)超家族成員,基因定位于19號染色體p13.11上[6]。已經有研究報道GDF15和MMP7可能參與胃癌的發生發展[7],但是關于GDF15、MMP7和胃癌預后的相關性研究仍鮮有報道。本研究即分析GDF15和MMP7蛋白表達與胃癌臨床病理特征及胃癌患者術后預后的相關性,為探索新的胃癌預后指標以及開發高效的靶向治療藥物提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 標本來源

研究所需樣本組織收集自重慶市黔江中心醫院2014-06～2016-03胃癌術后標本作為研究材料,共106例,其中女性胃癌患者61例,男性胃癌患者45例;平均年齡(58.65±12.57)歲;腫瘤直徑<4 cm 34例,腫塊≥4 cm 72例;有淋巴結轉移64例,無淋巴結轉移42例;TNM分期:Ⅰ、Ⅱ期48例,Ⅲ、Ⅳ期58例。所有患者術前均未接受化、放療。本研究經過重慶市黔江中心醫院倫理委員會審核批準,獲得所有受試者或者其家屬的書面同意書。

1.2 主要試劑和儀器

1.3 實時熒光定量PCR(qRT-PCR)

1.4 Western blot檢測胃癌組織和癌旁組織GDF15和MMP7蛋白表達

樣本研磨后,加蛋白裂解液,置冰上30 min,離心取上清液,測定蛋白濃度,垂直電泳,室溫下孵育二抗1 h,TBST洗膜3次,每次15 min。ECL顯色3-5 min,在暗室顯影。

1.5 免疫組織化學染色檢測胃癌組織和癌旁組織GDF15和MMP7蛋白表達

用4%福爾馬林對腫瘤樣本和對照組織進行固定,然后進行石蠟包埋,在石蠟切片機進行切片,厚度為5 μm。脫蠟后進行免疫組織化學染色。簡要步驟如下:100 ℃條件下抗原修復5 min,PBS洗3次。加10%羊血清室溫封閉30 min。放在搖床上,4 ℃條件下過夜孵育一抗。37 ℃條件下孵育辣根過氧化物酶標記的二抗30 min,室溫下PBS洗3次,每次5 min,雙蒸水洗一次。滴加事先配好的DAB顯色液,光鏡下觀察顯色程度。蘇木素復染后脫水,中性樹膠封片晾干后觀察拍照。

1.6 免疫組化結果判定標準

細胞染色強度評分標準:無顯色為0分,呈淺黃色為1分,棕黃色為2分,棕褐色為3分。陽性細胞數評分標準:陽性細胞占總細胞數的0%-10%設為0分,10%-50%設為1分,50%-80%設為2分,80%-100%設為3分。染色強度評分和陽性細胞數評分的乘積≥3者為陽性,<3者則為陰性。

1.7 統計學處理

采用SPSS 17.0軟件對實驗數據進行統計分析,計數資料采用χ2檢驗,計量資料組間差異采用t檢驗,采用Kaplan-Meier進行單因素生存分析。當P<0.05時認為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 GDF15 mRNA和MMP7 mRNA在胃癌組織和癌旁組織中的表達

qRT-PCR實驗結果顯示,與癌旁正常胃組織相比,胃癌組織中GDF15 mRNA和MMP7 mRNA表達水平均升高(見圖1)。

2.2 GDF15蛋白和MMP7蛋白在胃癌組織與癌旁組織中的表達

Western blot實驗結果顯示,與癌旁正常胃組織相比,胃癌組織中GDF15蛋白和MMP7蛋白表達量均增多(見圖2)。對免疫組織化學結果進行量化分析,GDF15在胃癌組織中的陽性表達率為73.58%,明顯高于癌旁正常胃組織表達率(26.32%),差異有統計學意義(χ2=44.80,P=0.000 1,見圖3,表1)。胃癌組織中MMP7表達陽性率為78.30%,明顯高于癌旁正常胃組織表達率(46.32%),差異有統計學意義(χ2=22.03,P=0.000 1,見圖3,表1)。

2.3 胃癌組織中GDF15蛋白和MMP7蛋白的表達與相關臨床參數的關系

GDF15蛋白與腫瘤直徑有關(χ2=5.527,P=0.019),與年齡、性別、淋巴結轉移和TNM分期無關。MMP7蛋白和淋巴結轉移(χ2=8.043,P=0.005)和TNM分期(χ2=9.717,P=0.002)有關系,與年齡、性別和腫瘤直徑無關(P>0.05,見表2)。

2.4 胃癌組織中GDF15和MMP7蛋白表達與胃癌患者預后相關性

Kaplan-Meier生存曲線分析顯示,GDF15陰性胃癌患者生存率比GDF15陽性胃癌患者更高(χ2=6.531,P<0.01,見圖4A),MMP7陰性胃癌患者生存率大于陽性胃癌患者(χ2=4.278,P<0.05,見圖4B)。

與癌旁組織比較,*P<0.05,**P<0.01圖1 GDF15 mRNA和MMP7 mRNA在胃癌組織和癌旁組織中的表達水平Figure 1 The expression levels of GDF15 mRNA and MMP7 mRNA in gastric carcinoma tissues and paired adjacent tissues

與癌旁組織比較,*P<0.05,**P<0.01圖2 Western blot檢測GDF15蛋白和MMP7蛋白在胃癌組織和癌旁組織中的表達水平Figure 2 The expression levels of GDF15 protein and MMP7 protein in gastric carcinoma tissues and paired adjacent tissues byWestern blot

圖3 GDF15蛋白和MMP7蛋白在胃癌組織和癌旁組織中表達的SP染色 (×200)Figure 3 The expression levels of GDF15 protein and MMP7 protein in gastric carcinoma tissues and paired adjacent tissues by SP (×200)

表1GDF15和MMP7在胃癌和癌旁正常組織陽性表達率的比較例(%)

Table1ComparisonofpositiveexpressionrateofGDF15andMMP7betweengastriccancertissueandnormaltissueadjacenttocarcinomacases(%)

組別nGDF15MMP7陰性陽性χ2P陰性陽性χ2P 胃癌組織10628(26.42)78(73.58)5.8040.00023(21.70)83(78.30)5.0530.000 癌旁組織9570(73.68)25(26.32)51(53.68)44(46.32)

3 討論

胃癌是死亡率非常高的惡性腫瘤,術后復發以及化療副作用使胃癌患者預后較差,尤其是晚期胃癌患者平均生存期還不到一年[8]。因此,研究胃癌發病的具體分子機制,鑒定胃癌早期診斷和理想的預后標志物,篩選高效藥物治療靶點,對提高胃癌患者的生存率有重要意義。生長分化因子15(growth differentiation factor-15,GDF15)作為轉化生長因子-β超家族中的一員,在人體組織中廣泛表達。GDF15可被多種因素誘導表達,通過SMAD通路和非SMAD通路發揮作用[9]。在不同微環境下,GDF15對于血管生成有關鍵作用。GDF15與基質金屬蛋白酶7(matrix metalloproteinase 7,MMP7)對腫瘤血管生成均有調控作用[10],故選擇這兩個分子進行研究。

表2胃癌組織中GDF15和MMP7的表達與相關臨床病理參數的關系例(%)

Table2AssociationbetweentheexpressionofGDF15andMMP7ingastriccarcinomatissuesandclinicopathologicalparameterscases(%)

病理參數nGDF15MMP7陰性陽性χ2P陰性陽性χ2P年齡 0.10170.7500.5650.452 <60歲3911(28.21)28(71.79)10(25.64)29(74.36) ≥60歲6717(25.37)50(74.63)13(19.40)54(80.60)性別1.925 0.1650.1330.716 男4515(33.33)30(66.67)9(0.20)36(0.80) 女6113(21.31)48(78.69)14(22.95)47(77.05)腫瘤直徑5.527 0.0193.3450.067 <4 cm34 4(11.76)30(88.24)11(32.35)23(67.65) ≥4 cm7224(33.33)48(66.67)12(16.67)60(83.33)淋巴結轉移0.509 0.4768.0430.005 有6421(32.81)43(67.19) 8(12.50)56(87.50) 無4227(64.29)15(35.71)15(35.71)27(64.29)TNM分期0.090 0.7649.7170.002 Ⅰ、Ⅱ期4812(0.25) 36(0.75) 17(35.42)31(64.58) Ⅲ、Ⅳ期5816(27.59)42(72.41) 6(10.34)52(89.66)

圖4 胃癌組織中GDF15和MMP7蛋白表達與患者總生存期的關系Figure 4 Relationship between the expression of GDF15 and MMP7 in gastric carcinoma tissues and overall survival of gastric cancer patients

GDF15被發現在多種癌癥的腫瘤組織中高表達,轉錄生長因子受體2介導的信號途徑能夠調控GDF-15的表達。在直腸癌的研究中,發現GDF15通過綁定TGF-β受體激活Smad2和Smad3信號途徑,促進上皮間質轉化和腫瘤轉移。胃癌患者血漿和血清中GDF15水平比健康對照明顯升高,并且血漿中升高的GDF15水平與胃癌病人較差的預后相關[11,12]。Ishige等[13]研究發現,GDF15在胃癌組織高表達,胃癌患者血清GDF15水平顯著高于健康對照和胃炎患者,并與壁浸潤和淋巴結轉移呈正相關。GDF15還能促進成纖維母細胞激活。GDF15蛋白在胃癌組織的表達以及與胃癌患者預后的相關性仍不明確。與既往報道結果一樣,本研究發現胃癌組織GDF15 mRNA和蛋白表達水平比癌旁正常組織明顯升高,GDF15在胃癌組織中的陽性表達率明顯高于癌旁正常胃組織。重要的是,本次研究最新發現,GDF15蛋白陽性表達與腫瘤直徑大小相關,GDF15陰性胃癌患者生存率比GDF15陽性胃癌患者更高。

既往研究表明,胃癌的侵襲和轉移與腫瘤細胞遷徙、黏附關系緊密,并且細胞外基質降解、腫瘤血管生成在胃癌的侵襲、轉移過程具有重要作用[14,15]。腫瘤細胞浸潤和轉移的關鍵是穿透宿主組織,該過程涉及到細胞外基質的破壞。在胃癌細胞,MMP7能夠特異性降解腫瘤細胞外生理與病理性基質的降解和基底膜成分,從而促進胃癌的侵襲和轉移[16]。Sentani等[17]發現,胃癌組織中MMP7蛋白的表達水平明顯高于癌旁正常組織,并且MMP7強陽性的胃癌患者表現出較強的浸潤胃壁及淋巴管、血管滲透能力。異檸檬酸脫氫酶2(isocitrate dehydrogenase 2)通過核轉錄因子NF-κB(nuclear factor κB)信號途徑抑制MMP7表達,從而抑制胃癌細胞的侵襲能力[18]。研究證明,抑制表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor,EGFR)信號通路后,MMP7蛋白表達下調,胃癌轉移能力下降[19]。MMP7是Wnt/β-cat信號通路的下游靶基因,受Wnt/β-catenin信號通路調控的MMP7進一步參與到基底膜和細胞外基質分解過程,最終造成腫瘤侵襲、轉移[20]。本研究顯示,胃癌組織中MMP7蛋白高表達,并且與胃癌淋巴結轉移和TNM分期相關,說明MMP7和胃癌侵襲性具有直接關系。重要的是,Kaplan-Meier生存曲線分析顯示,MMP7陰性胃癌患者生存率大于陽性胃癌患者。

綜上所述,GDF15和MMP7是影響胃癌患者術后生存的危險因素,可以作為評估胃癌患者預后良好與否的參考指標。GDF15和MMP7可能成為新的胃癌治療靶點。