脂聯素對高糖條件下RF/6A細胞的保護作用

李 蓉,杜軍輝,姚國敏,王小娣,姚 楊

(1西安醫學院第一附屬醫院眼科,西安 710077;2西安交通大學附屬西安市第九醫院眼科;3西安醫學院第一附屬醫院中心實驗室;*通訊作者,E-mail:rechelrong198222@163.com)

糖尿病視網膜病變(diabetic retinopathy,DR)是糖尿病最常見的嚴重并發癥之一[1],高血糖導致視網膜微血管慢性損傷,最終出現增生性DR(proliferative DR,PDR)嚴重危害患者視力健康[2],影響其生存質量,并帶來巨大的社會負擔?？剐律芩幬锏某霈F為PDR帶來了治療前景[3],但并非對所有患者均治療有效,故研究DR的發病機制,探索新生血管治療的新策略尤為重要。

研究表明,脂肪細胞分泌的生物活性物質脂聯素(adiponectin,APN)與糖尿病等多種代謝性疾病的發生有關,APN在這些疾病中可能發揮有益作用[4-6]。在APN與病理性視網膜新生血管方面的研究提示,APN對缺血缺氧導致的視網膜血管損傷起著保護作用[7,8],但APN在各種代謝性疾病中發揮保護作用的分子機制還不完全清楚。據報道,高糖可以誘導人臍靜脈內皮細胞損傷,促進細胞凋亡[9]。本研究旨在觀察APN是否能促進高糖條件下的RF/6A細胞增殖,抑制細胞凋亡,從而對RF/6A細胞起到保護作用。

1 材料和方法

1.1 主要試劑與儀器

RF/6A細胞(武漢普諾賽生命科技有限公司),1640培養基、0.25%胰酶(美國Gibco公司),胎牛血清(美國Invitrogen公司),青霉素、鏈霉素(美國Hyclong公司);APN(金斯瑞生生物科技有限公司),CCK-8細胞增殖及細胞毒性檢測試劑盒(碧云天生物技術有限公司),細胞凋亡檢測試劑盒(南京凱基生物科技發展有限公司)。兔單抗Bax(美國Cell signaling公司),兔單抗Bcl2(美國Cell signaling公司),兔多抗GAPDH(杭州賢至生物有限公司),HRP標記羊抗兔二抗(武漢博士德生物工程有限公司),BCA蛋白濃度測定試劑盒(碧云天生物技術有限公司)。MCO-15AC型CO2恒溫培養箱(日本SANYO),Multiskan MK3型全自動酶標儀(美國Thermo scientific),CytoFLEX型流式細胞儀(美國BECKMAN)。

1.2 細胞傳代培養

將RF/6A細胞置于含有10%胎牛血清、100 U/ml青霉素和100 μg/ml鏈霉素的1640培養基中,在37 ℃、5% CO2及飽和濕度條件下常規培養。當細胞的密度達到80%時,用0.25%胰酶消化細胞,終止消化后收集細胞,PBS清洗細胞2次,1 200 r/min,離心3 min,加入培養基,制成單細胞懸液,按1 ∶3的比例傳代,37 ℃、5% CO2及飽和濕度條件下擴大培養。

1.3 細胞處理及分組

將處于對數生長期的RF/6A細胞消化,用相應培養基制備單細胞懸液,按照每孔5×105個細胞接種于6孔板,按照如下分組進行加藥處理:空白對照組(PBS),甘露醇對照組(25 mmol/L甘露醇),高糖組(25 mmol/L D-葡萄糖),高糖+APN組(25 mmol/L D-葡萄糖+10 μg/ml APN),在37 ℃、5%CO2及飽和濕度條件下培養48 h。

1.4 CCK-8法檢測RF/6A細胞增殖

消化處于對數生長期的細胞,用培養基制成5×104個細胞/ml的單細胞懸液,將細胞接種于96孔板(每孔100 μl),同時設置空白對照孔,周圍孔加入100 μl PBS,在37 ℃、5% CO2及飽和濕度條件過夜培養。按照上述分組加藥處理48 h,向每孔加入10 μl CCK-8溶液,37 ℃培養4 h,振蕩10 min,用全自動酶標儀測定各孔在450 nm處的吸光值(OD)。計算細胞增殖率(%)=(各組平均OD值-空白孔平均OD值)/(對照組平均OD值-空白孔平均OD值)×100%。

1.5 流式檢測RF/6A細胞凋亡

用不含EDTA的0.25%胰酶消化細胞,終止消化后收集細胞;PBS清洗2次,1 500 r/min,5 min;按照Annexin Ⅴ-APC-7-AAD細胞凋亡檢測試劑盒說明操作:加入500 μl Binding Buffer,重懸細胞;5 μl AnnexinⅤ-APC混勻后加入5 μl 7-AAD,混勻;室溫避光反應15 min(同時設陰性對照,即正常細胞不加Annexin Ⅴ-APC-7-AAD);流式細胞儀檢測。

1.6 Western blot檢測RF/6A細胞凋亡蛋白Bax、Bcl-2的表達

細胞處理完成之后,收集各組細胞,用預冷PBS洗滌3次,加入含有蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液100 μl,混勻,4 ℃、12 000 r/min離心5 min,取上清,BCA法測定蛋白濃度,取40 μg等量蛋白上樣。SDS-PAGE凝膠電泳,轉膜,用含5%脫脂奶粉的TBST(封閉液)室溫浸泡PVDF膜2 h。用封閉液稀釋相應的一抗(1 ∶1 000),使PVDF膜浸泡于一抗孵育液中,4 ℃孵育過夜。TBST洗滌5次,每次5 min,加入辣根過氧化酶標記的二抗(1 ∶50 000),室溫孵育2 h,洗膜后ECL顯色,沖洗晾干后掃描膠片,BandScan凝膠成像系統分析膠片灰度值。以GAPDH為內參,以目的蛋白/GAPDH條帶灰度值作為其相對表達量。

1.7 統計學分析

2 結果

2.1 APN對高糖條件下RF/6A細胞增殖的影響

CCK-8檢測結果顯示,空白對照組、甘露醇對照組、高糖組、高糖+APN組的RF/6A細胞增殖率分別為100%±0%,99.09%±0.46%,71.42%±2.29%,90.87%±1.68%。各組總體比較差異具有統計學意義(F=254.16,P<0.001)?？瞻讓φ战M與甘露醇對照組之間的差異無統計學意義(P>0.05)。高糖組和高糖+APN組細胞增殖率比空白對照組和甘露醇對照組降低(均P<0.001)。與高糖組相比,高糖+APN組細胞增殖率明顯升高(P<0.001,見圖1)。

與空白對照組比較,*P<0.001;與甘露醇對照組比較,#P<0.001;與高糖組比較,&P<0.001圖1 各組RF/6A細胞增殖率的比較Figure 1 Comparison of the proliferation rate of RF/6A cells among four groups

2.2 APN對高糖條件下RF/6A細胞表達凋亡相關蛋白的影響

Western blot檢測結果顯示,與空白對照組和甘露醇對照組比較,高糖組細胞的凋亡增強,分別表現為兩種凋亡標志蛋白Bax(促進凋亡)表達條帶的明顯增強和Bcl-2(抑制凋亡)的明顯減弱。當采用APN處理細胞后,Bax的表達則明顯降低,而Bcl-2的表達明顯升高(見圖2)。空白對照組、甘露醇對照組、高糖組和高糖+APN組細胞中,Bax的相對表達量分別為0.28±0.02,0.29±0.02,0.64±0.01和0.54±0.03;Bcl-2的相對表達量分別為0.64±0.01,0.66±0.01,0.28±0.01和0.39±0.01。Bax和Bcl-2的相對表達組間總體比較差異均有統計學意義(F=257.13,P<0.001;F=1087.54,P<0.001)。組間比較顯示,空白對照組與甘露醇對照組之間的差異無統計學意義(P>0.05)。高糖組和高糖+APN組細胞Bax的表達比空白對照組和甘露醇對照組增多,Bcl-2的表達較這兩組減少(均P<0.001)。與高糖組相比,高糖+APN組細胞Bax的表達明顯降低,Bcl-2的表達明顯升高(均P<0.001,見圖3)。

圖2 Western blot檢測各組RF/6A細胞Bax和 Bcl-2的蛋白表達Figure 2 Expression of Bax and Bcl-2 in different groups by Western blot

2.3 APN對高糖條件下RF/6A細胞凋亡率的影響

流式細胞儀檢測結果顯示,與空白對照組和甘露醇對照組比較,高糖組細胞的凋亡率增加,高糖+APN組細胞凋亡率則明顯下降(見圖4)?？瞻讓φ战M、甘露醇對照組、高糖組和高糖+APN組細胞的凋亡率分別為5.17±0.27，5.55±0.35，18.37±0.44和10.46±0.70。組間總體比較差異有統計學意義(F=518.86,P<0.001)。組間比較提示,空白對照組與甘露醇對照組之間的差異無統計學意義(P>0.05)。高糖組和高糖+APN組細胞凋亡率比空白對照組和甘露醇對照組增多(P<0.001)。與高糖組相比,高糖+APN組細胞凋亡率明顯減少(P<0.001,見圖5)。

3 討論

DR是全球工作年齡人群致盲的首要原因,其臨床特征主要是毛細血管通透性增加、視網膜水腫以及內皮細胞增生[10]。糖尿病導致DR發生的機制十分復雜,雖經過多年的體內外研究,但目前對DR的發生和發展機制尚未完全明確。既往關于糖尿病并發癥的機制研究主要集中在多元醇通路、非酶糖基化學說、氧化應激和蛋白激酶C的活化這五個經典途徑,視網膜細胞的凋亡是各種機制的共同通路[11]。細胞凋亡是生物體為維持內環境穩定,細胞在一定的生理或病理條件下,由基因控制的高度有序的細胞程序性死亡,是生物體為了更好地適應生存環境而主動結束其生命的過程,涉及一系列基因的激活、表達以及調控過程[12]。本研究結果提示,高糖刺激可以明顯減少RF/6A細胞增殖,導致其細胞活力下降,與文獻報道的結果一致[13]。進一步流式和免疫印跡法分析結果提示,凋亡增加是高糖導致細胞增殖活力下降的原因之一,與采用其他方法檢測凋亡所取得的結果類似[13]。

與空白對照組比較,*P<0.001;與甘露醇對照組比較,#P<0.001;與高糖組比較,&P<0.001圖3 各組RF/6A細胞Bax和Bcl-2的相對蛋白表達量Figure 3 The relative expression of Bax and Bcl-2 by RF/6A cells in different groups

圖4 流式細胞儀檢測各組RF/6A細胞凋亡率Figure 4 Cellular apoptosis rate in different groups by flow cytometry

與空白對照組比較,*P<0.001;與甘露醇對照組比較,#P<0.001;與高糖組比較,&P<0.001圖5 各組RF/6A細胞凋亡率的比較Figure 5 The apoptosis rate of RF/6A cells in different groups

視網膜細胞凋亡已被視為導致視網膜神經退行性改變、血管功能異常、DR、青光眼等不可逆致盲眼病的中心事件[14]。在DR大鼠模型中發現,在糖尿病發生早期就可見到血管細胞和視網膜神經節細胞凋亡發生,血管周細胞的凋亡導致血視網膜屏障破壞,視網膜神經節細胞的凋亡導致視功能的損傷[14]。糖尿病誘導視網膜細胞凋亡的機制雖然仍不十分明確,但與這些細胞凋亡密切相關的基因主要包括bcl-2家族。Bcl-2是研究最早且與凋亡有關的原癌基因,是人類濾泡型淋巴瘤的細胞遺傳標志物,其表達蛋白可以抑制凋亡。Bcl-2蛋白廣泛存在于造血細胞、上皮細胞、淋巴細胞、神經細胞及多種瘤細胞。目前認為該家族可細分成兩大類:抗凋亡基因,如Bcl-2、Bcl-XL、Bcl-W等和促凋亡基因,如Bax、Bik、Bak等[15]。本研究提示,RF/6A細胞表達Bcl-2和Bax這兩種凋亡關鍵蛋白,高糖作用后促凋亡蛋白Bax表達明顯升高,抑制凋亡蛋白Bcl-2表達明顯下降,與在周細胞中觀察到的結果相似。研究者也將視網膜毛細血管周細胞置于高濃度的葡萄糖溶液中體外培養,觀察到毛細血管周細胞的大量凋亡,并且細胞中Bax基因表達增強與Bcl-2基因表達減少,認為二者的表達變化對周細胞的凋亡起到了調控作用[16]。進一步研究提示,上述改變主要與高糖所致的氧化應激損傷引起線粒體功能紊亂,啟動細胞內凋亡信號轉導途徑有關。Bcl-2家族在此過程中起主要的調節作用,在高血糖狀態下,Bcl-2的含量降低、Bax含量增加,線粒體膜通透性增高,激活caspase-9及caspase-3等重要作用的蛋白酶,從而促進后續的細胞凋亡信號[17]。

APN是一種主要由脂肪細胞特異性分泌的生物活性物質,編碼人脂聯素的基因位于染色體3q27,該位點與糖尿病和心血管疾病的易患性相關。近年研究發現,APN是聯系脂肪細胞、心肌細胞和血管細胞的重要媒介,且與腫瘤的侵襲和轉移有關[18]。APN的功能尚未完全證實,能夠通過多種復雜信號通路調節機體糖、脂代謝,與多種代謝性疾病的發生和發展有關。人類APN的血清水平與脂肪量呈反比,是唯一與脂肪組織呈負相關、對人體起保護作用的脂肪因子,具有抗炎、抗動脈粥樣硬化、增加胰島素敏感性和抑制血管生成的作用[19,20]。臨床研究發現,較低濃度的血清總APN和高分子量APN水平可能參與非增殖性DR的發生,總APN水平可能與DR的嚴重程度有關[21]。血清APN水平是DR病變的獨立危險因素,參與了DR的發生和發展,可作為預測評估糖尿病患者視網膜病變損傷程度的指標[22]。在視網膜血管病變的動物模型中發現,APN是視網膜病理性微血管形成的負向調控者,對視網膜血管損傷起著保護作用[7,8]。本研究結果表明,APN可以促進高糖條件下的RF/6A細胞的存活及增殖,抑制細胞凋亡,提示APN對高糖所致的RF/6A細胞損傷起一定的保護作用。