微小RNA-3680-3p在腎癌組織中的表達及對人腎癌細胞ACHN遷移和增殖的影響

王 斌,李 建,何 軒,耿明英,金 豐,王 閣,王 東,宋 揚

(陸軍軍醫大學第三附屬醫院野戰外科研究所腫瘤中心,重慶 400042;*通訊作者,E-mail:songyang84zhu@163.com)

腎癌是泌尿系統第二常見的惡性腫瘤,發病率僅次于膀胱癌[1]。腎癌的早期轉移導致很多患者的預后并不理想。研究腎癌發生發展的機制和有效的分子靶向治療,是腎癌臨床治療亟待解決的難題。微小RNA(miRNA)是一種人體內源性小分子單鏈RNA,長19-25個核苷酸,主要在轉錄后水平發揮基因調節作用[2]。miRNA通過與基因mRNA的3′非編碼區結合,誘導靶基因mRNA的降解或者直接抑制其翻譯[3]。越來越多的miRNA被發現與腎癌的增殖、遷移、侵襲等惡性生物學行為密切相關,miRNA在腎癌發生發展中的機制研究已成為腎癌研究領域的重要方向[4]。miR-3680-3p是一種新發現的miRNA,其在疾病特別是腫瘤中的作用少有報道。本研究旨在通過生物信息學技術探究miR-3680-3p在腎癌細胞中的作用機制,并觀察miR-3680-3p對腎癌細胞遷移和增殖的影響。

1 材料與方法

1.1 組織標本來源

16例腎癌及癌旁組織標本來自陸軍軍醫大學第三附屬醫院野戰外科研究所腫瘤中心,為泌尿外科住院治療的患者經手術切除的標本,本研究經陸軍軍醫大學第三附屬醫院倫理委員會批注,患者均簽署知情同意書。

1.2 細胞株及主要試劑

人腎癌細胞株ACHN購于上海信然生物技術有限公司。野生型與突變型VEGF-C 3′非翻譯區熒光素酶報告基因質粒(pGL-4載體)由南京諾唯贊生物科技有限公司設計并合成;雙熒光素酶報告基因檢測實驗試劑盒購于美國Promega公司;實時定量聚合酶鏈反應(qPCR)試劑盒購于日本TaKaRa公司;攜帶miR-3680-3p的慢病毒、陰性對照慢病毒、miR-3680-3p模擬物和miR-NC購于上海吉瑪公司;Transwell小室購于美國Corning公司;噻唑藍(MTT)試劑盒購于美國Sigma公司;超敏ECL發光試劑盒購于美國Thermo公司;一抗VEGF-C、N-cadherin、Zeb-2、CDK4、Cyclin A1和GAPDH購于美國Abcam公司。

1.3 細胞培養和感染

人腎癌細胞株ACHN用含10%胎牛血清的DMEM培養基培養,于37 ℃、5% CO2條件下培養。將對數生長期的ACHN細胞接種于24孔板,待細胞匯合度達到50%時,按照慢病毒感染說明書進行感染,分別感染陰性對照慢病毒和攜帶miR-3680-3p的慢病毒,分為對照組和實驗組。感染后第24小時觀察ACHN細胞狀態并更換新鮮培養基。

1.4 qPCR檢測miR-3680-3p和VEGF-C的表達水平

按照Trizol法提取組織或細胞中總RNA并逆轉錄為cDNA。以U6或GAPDH作參照,分別應用miR-3680-3p和VEGF-C引物通過qPCR試劑盒擴增檢測miR-3680-3p和VEGF-C的表達水平。U6上游引物:5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′,下游引物5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′;miR-3680-3p上游引物:5′-GGTTTTGCATGACCCTGGG-3′,下游引物5′-CAGTGCGTGTCGTGGAGT-3′;VEGF-C上游引物:5′-GGCTGGCAACATAACAGAGAA-3′,下游引物5′-CCCCACATCTATACACACCTCC-3′;GAPDH上游引物:5′-ACAACTTTGGTATCGTGGAAGG-3′,下游引物5′-GCCATCACGCCACAGTTTC-3′。qPCR反應條件:95 ℃預變性8 min,95 ℃變性8 s,63 ℃退火15 s,72 ℃延伸15 s,反應40個循環。數據結果應用2-ΔΔCt方法分析。

1.5 生物信息學預測和雙熒光素酶報告基因檢測實驗驗證miR-3680-3p的靶基因

結合生物信息學預測軟件DIANA TOOLS、TargetScan及miRWalk預測miR-3680-3p的靶基因。野生型VEGF-C 3′非翻譯區質粒命名為VEGF-C 3′ UTR-WT,突變型VEGF-C 3′非翻譯區質粒命名為VEGF-C 3′ UTR-MUT。將對數生長期的ACHN細胞接種至6孔板,待細胞匯合度達50%,將miR-NC或miR-3680-3p模擬物分別與VEGF-C 3′ UTR-WT或VEGF-C 3′ UTR-MUT質粒,采用Lipofectamine?3000共轉染至ACHN細胞。應用雙熒光素酶報告基因檢測實驗試劑盒檢測各組ACHN細胞的熒光,以螢火蟲熒光素酶活性和海腎熒光素酶活性的比值代表各組ACHN細胞的相對熒光素酶活性。

1.6 Western blot檢測靶基因的表達

胰酶消化收集兩組細胞,采用蛋白裂解液裂解細胞并提取總蛋白。每組上樣40 μg蛋白樣品至十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠,電泳后電轉至PVDF膜。封閉液封閉后,在4 ℃下分別孵育VEGF-C、Cyclin E1、CDK2、β-catenin、Vimentin和GAPDH一抗(稀釋比均為1 ∶1 000)并過夜。在室溫下孵育相應的二抗后,滴加超敏ECL發光試劑顯影,采用凝膠成像儀拍照。

1.7 Transwell實驗檢測ACHN細胞的遷移能力

胰酶消化收集兩組細胞,采用無血清DMEM培養基調整細胞密度為2×105個/ml。Transwell小室內加入200 μl細胞懸液,Transwell小室外加入700 μl含10%胎牛血清的DMEM培養基。培養箱內培養第24小時,采用甲醇在室溫下固定15 min,采用結晶紫染液在室溫染色15 min,采用流水沖洗,棉簽擦去未穿過底膜的細胞后晾干。顯微鏡下隨機選取4個視野計算穿膜ACHN細胞數,取平均數。

1.8 MTT法檢測ACHN細胞的增殖能力

胰酶消化收集兩組細胞,調整細胞密度,以4 000個/孔接種至96孔板,每孔加入200 μl培養基。培養第1,2,3,4,5天,每孔分別加入5 mg/ml的MTT試劑20 μl,培養箱內培養4 h,棄上清,每孔加入200 μl二甲基亞砜,搖床振蕩至結晶溶解,使用酶標儀檢測各孔在波長495 nm處的吸光度(A)值。

1.9 統計學分析

2 結果

2.1 腎癌組織中miR-3680-3p的表達

qPCR檢測結果顯示,腎癌組織和癌旁組織中miR-3680-3p的表達量分別為1.58±0.15和3.44±0.11,癌旁組織miR-3680-3p的表達量為腎癌組織的2.18倍,差異有統計學意義(t=9.83,P<0.01,見圖1)。

與癌旁組織比較,**P<0.01圖1 腎癌組織中miR-3680-3p的表達量Figure 1 Expression of miR-3680-3p in renal cell carcinoma

2.2 ACHN細胞感染miR-3680-3p病毒的效率

qPCR檢測結果顯示,對照組和實驗組細胞中miR-3680-3p的表達量分別為1.04±0.16和8.33±0.56,實驗組miR-3680-3p的表達量為對照組的8.00倍,差異有統計學意義(t=12.59,P<0.01,見圖2)。

2.3 生物信息學預測結果

結合生物信息學預測軟件DIANA TOOLS、TargetScan及miRWalk的分析預測miR-3680-3p的靶基因是VEGF-C,具體的結合序列見圖3。

與對照組比較,**P<0.01圖2 對照組和實驗組ACHN細胞中miR-3680-3p的表達量Figure 2 Expression of miR-3680-3p in ACHN cells in control group and experimental group

圖3 miR-3680-3p與VEGF-C 3′-UTR互補結合的序列Figure 3 Sequence of miR-3680-3p complementary to VEGF-C 3′-UTR

2.4 miR-3680-3p與VEGF-C的靶向結合驗證結果

圖3結果顯示,與VEGF-C 3′ UTR-WT相比,VEGF-C 3′ UTR-MUT由序列“UGCAAAA”突變為“ACGUUUU”。分別將miR-NC或miR-3680-3p模擬物與VEGF-C 3′ UTR-WT或VEGF-C 3′ UTR-MUT質粒轉染至ACHN細胞中,雙熒光素酶報告基因檢測實驗檢測相對熒光素酶活性,以驗證miR-3680-3p與VEGF-C的靶向結合。圖4結果顯示,miR-3680-3p可顯著減弱VEGF-C 3′ UTR-WT質粒轉染細胞的相對熒光素酶活性,而對VEGF-C 3′ UTR-MUT質粒轉染ACHN細胞的相對熒光素酶活性無作用,顯示miR-3680-3p可直接結合VEGF-C基因。

2.5 ACHN細胞轉染miR-3680-3p對VEGF-C mRNA表達的影響

qPCR檢測結果顯示,轉染后實驗組ACHN細胞中VEGF-C mRNA的表達量明顯低于對照組(0.19±0.05vs1.00±0.06),差異有統計學意義(t=9.79,P<0.01)。

2.6 VEGF-C蛋白的表達水平

為進一步探討miR-3680-3p在ACHN細胞中的作用機制,采用Western blot檢測轉染miR-3680-3p模擬物48 h后VEGF-C蛋白、細胞遷移相關蛋白、細胞增殖相關蛋白表達情況。結果顯示,與對照組相比,實驗組VEGF-C表達水平降低,細胞遷移相關蛋白N-cadherin和Zeb-2蛋白表達明顯減少,細胞增殖相關蛋白CDK4、Cyclin A1表達減少(見圖5)。

1.miR-3680-3p+VEGF-C 3′UTR-MUT;2.miR-3680-3p+VEGF-C 3′UTR-WT;3.miR-NC+VEGF-C 3′UTR-MUT;4.miR-NC+VEGF-C 3′UTR-WT;與第1組(miR-3680-3p+VEGF-C 3′UTR-MUT)相比,**P<0.01圖4 雙熒光素酶報告基因檢測實驗驗證miR-3680-3p與VEGF-C的靶向結合驗證Figure 4 Verification of the binding of miR-3680-3p to VEGF-C by dual luciferase reporter assay

圖5 miR-3680-3p對VEGF-C蛋白及相關蛋白表達的影響Figure 5 Effect of miR-3680-3p on the expression of VEGF-C protein and related proteins

2.7 miR-3680-3p對ACHN細胞遷移能力的影響

如圖6所示,對照組和實驗組細胞中穿膜細胞數分別為(166.90±22.81)個和(51.43±11.57)個。與對照組比較,實驗組穿膜細胞數明顯降低,差異有統計學意義(t=4.52,P<0.01),miR-3680-3p一定程度上抑制腎癌細胞ACHN的遷移。

2.8 miR-3680-3p對ACHN細胞增殖能力的影響

MTT檢測結果顯示,實驗組ACHN細胞在感染后第1,2天的A值差異無統計學意義(t=0.11,P>0.05;t=2.64,P>0.05);在第3,4,5天的A值低于對照組,差異均有統計學意義(t=3.50,P<0.05;t=3.58,P<0.05;t=4.23,P<0.05，見圖7)。表明miR-3680-3p一定程度上抑制腎癌細胞ACHN的增殖能力。

與對照組相比,**P<0.01圖6 miR-3680-3p對ACHN細胞遷移能力的影響Figure 6 Effect of miR-3680-3p on the migration ability of ACHN cells

與對照組比較,*P<0.05圖7 miR-3680-3p對ACHN細胞增殖能力的影響Figure 7 Effect of miR-3680-3p on the proliferation of ACHN cells

3 討論

腎癌是最常見的泌尿系統惡性腫瘤之一,腎癌的發病率逐年升高[5]。近年來的研究表明,miRNA廣泛參與調控腎癌的的發生、發展。如miR-200a、miR-30a-5p、miR-210-3p[6-8]在腎癌中表達顯著下調,具有抑制腎癌細胞生長或轉移的作用。如miR-21、miR-144-3p、miR-373、miR-720等[9-12]miRNA在腎癌中表達明顯上調,具有促進腎癌細胞增殖或轉移的作用。miR-3680-3p是一種新發現的miRNA,關于miR-3680-3p的研究報道很少。miR-3680-3p在腎癌中表達及對其發生發展的調控作用尚不明確。

本研究結果顯示,miR-3680-3p在腎癌組織中的表達明顯少于癌旁組織,表明miR-3680-3p在腎癌中的表達異常,miR-3680-3p可能在腎癌中發揮腫瘤抑制作用。為了研究miR-3680-3p對腎癌惡性生物學的影響,本研究通過慢病毒感染在腎癌細胞ACHN中過表達miR-3680-3p,利用Transwell和MTT法觀察ACHN細胞的遷移和增殖變化。與對照組相比,miR-3680-3p可明顯抑制腎癌細胞ACHN的遷移和增殖,miR-3680-3p在腎癌的生長和轉移中發揮重要作用。

本研究通過生物信息學預測軟件DIANA TOOLS、TargetScan及miRWalk分析表明,血管細胞生長因子C(VEGF-C)是miR-3680-3p的靶基因。VEGF-C屬于VEGF家族成員,最初在前列腺癌中被發現,主要作為一種可刺激血管細胞生長因子受體3磷酸化的細胞因子[13]。已有研究發現,VEGF-C可通過活化增殖與轉移信號分析,促進腫瘤細胞的增殖和轉移,發揮明顯的癌基因作用[14]。VEGF-C已被發現在宮頸癌、膀胱癌、結腸癌等[15-17]多種腫瘤中表達明顯升高,與患者的不良預后密切相關。有研究表明,VEGF-C在腎癌中的表達明顯升高,VEGF-C與腎癌的惡性生物學行為密切相關,VEGF-C可能作為腎癌的治療靶點。本研究通過雙熒光素酶報告基因檢測實驗結果顯示,miR-3680-3p可直接結合VEGF-C mRNA的3′ UTR區域;qPCR和Western blot表明,miR-3680-3p過表達可在mRNA和蛋白水平上抑制VEGF-C的表達。本研究結果顯示,VEGF-C蛋白表達降低后,細胞遷移相關蛋白N-cadherin和Zeb-2蛋白表達明顯減少,提示細胞遷移能力下降。細胞增殖相關蛋白CDK4、Cyclin A1表達減少,提示細胞增殖能力受到顯著抑制。miR-3680-3p可能通過降低VEGF-C基因的表達,抑制腎癌細胞的遷移和增殖能力。

綜上所述,本研究結果表明miR-3680-3p參與調控腎癌的發生發展,miR-3680-3p與VEGF-C存在直接的靶向作用關系。miR-3680-3p可通過降低VEGF-C基因的表達,抑制腎癌細胞ACHN的遷移和增殖能力。miR-3680-3p有望成為新的腎癌分子治療靶點。