百草枯中毒大鼠肺組織中KL-6黏糖蛋白和羥脯胺酸的表達及肺纖維化的變化

張 引,劉 陽,何靜春,劉亮亮,劉 斌,趙希洋*

(1武警特色醫學中心ICU,天津 300162;2天津市第四中心醫院呼吸內科;*通訊作者,E-mail:Lvcaoyiyi1985@163.com)

百草枯是使用較為廣泛的快速觸殺型除草劑之一[1,2],可致人畜中毒,其中毒機制目前尚不十分明確,因此缺少特異性的解毒劑,中毒病人的死亡率為85%-95%[3,4]。百草枯中毒的早期重癥病人一般死于臟器功能衰竭[5,6],而晚期病人則會出現嚴重的低氧血癥,大部分病人死于重度肺纖維化或者其綜合征,肺間質纖維化與許多炎性因子及氧化應激具有直接的關系[7,8]。由于肺組織存在多胺攝取體系,能夠主動攝取百草枯,因此百草枯對肺組織的損害最為嚴重,早期百草枯中毒病人多為急性肺損傷,而后期病人則會引發不可逆轉的廣泛的肺纖維化[9]。以往研究肺腺癌腫瘤標志物時發現,涎液化糖鏈抗原-6(krebs von den lungen-6,KL-6)黏糖蛋白水平能夠快速直接反映肺泡上皮和間質的損傷程度,其機制可能是KL-6黏糖蛋白能夠增強成纖維細胞增殖,因此對肺纖維化的發生以及發展產生一定程度影響[10,11]。研究表明KL-6黏糖蛋白與肺纖維化關系密切[12],大鼠腹腔注射百草枯可引發肺纖維化,該病理過程與人類百草枯中毒時肺纖維化的病理過程類似。故本實驗采用百草枯制作大鼠肺纖維化模型,觀察大鼠肺組織變化及測定肺組織羥脯胺酸(hydroxyproline,HYP)、探討KL-6糖蛋白在百草枯中毒致急性肺損傷及纖維化組織的表達。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及主要試劑

SPF級8周齡雄性SD大鼠54只,體質量250-280 g(購自中國人民解放軍軍事醫學科學院實驗動物中心、生產許可證號:SCXK-(軍)2007-004)。百草枯購自西格瑪奧德里奇(上海)貿易有限公司。KL-6黏糖蛋白抗體購自北京博奧森生物技術有限公司,羥脯氨酸含量測定試劑盒購自南京建成生物工程研究所,硫代巴比妥酸法MDA檢測試劑盒購自北京博奧森生物技術有限公司,硫代巴比妥酸法SOD檢測試劑盒購自北京博奧森生物技術有限公司。

1.2 建模、分組及提取標本

將54只大鼠適應性飼養1周后,使用隨機數字法分為百草枯模型組(n=27)和對照組(n=27)。百草枯模型組以0.4%百草枯稀釋溶液按照14 mg/kg的劑量行腹腔注射[13],對照組大鼠腹腔注射等量生理鹽水,分別于給藥后第7,14,28天處死前(每組9只大鼠)測量體質量,觀察大鼠精神狀態;摘除大鼠左肺;置-80 ℃凍存，測定大鼠的肺組織HYP含量、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)及丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量。

1.3 肺泡炎癥、肺纖維化程度判斷

大鼠肺組織石蠟切片HE染色,在光學顯微鏡下觀察肺組織病理學改變。根據Szapiel等[15]的方法評價肺組織病理改變:無肺泡炎癥或者無纖維化、且肺組織的受累面積為0時,標記為“-”;輕度肺泡炎癥或者纖維化、而且肺組織的受累面積<20%時,標記為“+”;中度肺泡炎癥或者纖維化、而且肺組織的受累面積為20%-50%時,標記為“++”;重度肺泡炎癥或者纖維化、而且肺組織的受累面積>50%時,標記為“+++”。

1.4 肺系數測定

大鼠建模成功后,在第7,14,28天時將大鼠頸錐脫臼處死、開胸取肺,用濾紙將肺表面的血水吸取干凈,用電子天平稱重,計算肺系數,肺系數=(大鼠的濕肺質量÷大鼠體質量)×100。

1.5 酸水解法測定肺組織HYP含量

大鼠肺組織研磨均漿,加6 mol/L氯化鉀溶液1 ml,130 ℃水解5 h，調節pH值6.5-7.0,加雙蒸水30 ml和0.05 mol/L的氯胺1.0 ml搖勻,室溫反應20 min,用ELISA法檢測HYP含量,按照HYP含量測定試劑盒說明書操作,取分光光度計在550 nm處測量吸光度值,計算羥HYP含量。

1.6 肺組織MDA含量和SOD活性測定

大鼠的肺組織研磨勻漿,4 000 r/min離心10 min,提取上清液2 ml,加0.6%TBA溶液2 ml,沸水浴15 min。利用硫代巴比妥酸法,按照MDA檢測試劑盒和SOD檢測試劑盒說明書操作,取上清液在532 nm和450 nm的波長處測量吸光度值。

1.7 肺組織KL-6黏糖蛋白含量測定

造模后第7天、第14天和第28天,通過尾靜脈采集外周血3 ml,置3.2%枸櫞酸鈉抗凝管,4 ℃保存,用ELISA測定KL-6定量,按照試劑盒說明書操作,使用酶標儀在450 nm處檢測吸光值,計算KL-6濃度。

1.8 統計學分析

2 結果

2.1 體質量及精神狀態

在三個不同時點檢測結果顯示,對照組大鼠體質量增加、精神狀況較好;而百草枯模型組大鼠的體質量先下降,在第28天時開始回升,但與同期對照組比較體質量仍較輕,差異有統計學意義(P<0.05,見圖1)。百草枯組大鼠給藥第7天時,精神萎靡、精神不振、進食變少、活動量降低、呼吸急促、口鼻有血性分泌物,第28天時精神轉好、活動量和體質量增加。

2.2 兩組大鼠染毒后的肺組織水腫情況

百草枯模型組大鼠中毒第7天時,大鼠的肺組織出現水腫,肺泡間隔開始變寬,肺泡腔內有滲出,肺毛細管擴張充血,可見中性粒細胞以及單核巨噬細胞浸潤;中毒后第14天,肺組織的充血情況減少,部分肺葉少量瘀血,肺部腫脹變輕,肺內的炎性細胞集中,膠原纖維增多;中毒后第28天時,肺泡結構變寬、塌陷,炎性浸潤減輕,膠原纖維以及纖維細胞出現(見圖2)。

圖1 實驗不同時間點兩組大鼠體質量變化Figure 1 Changes of body mass of rats in two groups at different time points

圖2 兩組大鼠染毒后的肺組織水腫情況 (免疫組化SP法,×400) Figure 2 Pulmonary edema after exposure in two groups (immunohistochemical SP method,×400)

2.3 兩組大鼠染毒后的肺系數變化

百草枯模型組大鼠隨著染毒時間延長,其肺系數明顯增加,在第14天時達到最大值,之后其肺系數開始降低,差異有統計學意義(P<0.05,見圖3),提示百草枯組大鼠在中毒后第14天時肺水腫。

2.4 肺組織HYP含量

百草枯模型組大鼠隨著染毒時間的延長,肺組織HYP含量增多,與同期對照組比較,差異有統計學意義(P<0.05,見圖4)。

2.5 肺組織SOD活性及MDA含量

百草枯組大鼠隨著染毒時間的延長,肺組織中SOD的活性增加,到第28天時SOD含量表達最強;肺組織中MDA含量降低,至第28天時其含量表達最低,差異有統計學意義(P<0.05,見圖5)。

2.6 KL-6在大鼠肺組織內的含量

百草枯大鼠隨著染毒時間的延長,肺組織中KL-6的表達增加,到第28天時肺組織內的KL-6含量表達最強,差異有統計學意義(P<0.05,見圖6)。

圖3 兩組大鼠肺系數的變化Figure 3 The changes of lung coefficients in the two groups

圖4 兩組大鼠HYP的含量Figure 4 Contents of HYP in rats in two groups

圖5 兩組大鼠肺組織SOD活性和MDA含量的比較Figure 5 Changes of SOD activity and MDA content in lung tissues of rats at different time points in two groups

圖6 各組大鼠肺組織KL-6平均光密度值Figure 6 Average optical density of KL-6 in lung tissue of rats in each group

3 討論

我國是目前百草枯最大的生產國以及最大的使用國[14,16]。百草枯中毒的病死率大約為85%-95%,幸存者亦存在肺纖維化,預后的效果不理想[17]。百草枯中度的中毒病人在染毒后的1 d內會很快出現急性肺損傷的特征,然后就會轉為急性呼吸窘迫綜合征,如果第7天時病人仍然為存活的狀態,其肺部損傷就會出現逐漸加重的狀況,從而發展為不可逆的肺間質纖維化,后期的病人一般死于呼吸衰竭。羥脯氨酸是膠原纖維所具有的特征物。而肺纖維化的前提是膠原纖維,故通過對羥脯氨酸含量進行檢測,從而能夠對膠原含量進行間接反映,能夠將其作為檢測膠原代謝的重要因素。KL-6是一類肺泡Ⅱ型上皮細胞分泌的大分子唾液酸糖蛋白，大部分于肺泡Ⅱ型上皮細胞表面表達，有佷少部分的表達在正常肺部組織以及終末細支氣管肺泡上皮細胞表面，而其在肺泡Ⅰ型上皮細胞上并不表達[18]。肺間質性病變病人血清中KL-6黏蛋白的水平與其他呼吸系統疾病病人進行對比,其KL-6黏蛋白的水平出現明顯升高[19]。日本研究學者的研究結果表明血清中的KL-6黏蛋白水平比500 U/ml高,是結締組織病并發間質性肺疾病的特征。此外,活動期間質性肺病病人與非活動期間質性肺病病人進行對比發現,在活動期間質性肺病病人的血清中KL-6黏蛋白的水平含量出現明顯升高,而濃度較高的血清中的KL-6黏蛋白水平與迅速進展致間質性肺病具有直接的關系。因此,KL-6黏蛋白水平對于研究這類疾病具有很大價值[20],KL-6黏蛋白水平的數值變化能夠直接對肺病疾病狀態進行反映。此外,百草枯中毒后肺組織中SOD的活性增加,且肺組織內的SOD含量表達增強。這表明百草枯中毒早期以氧化還原損傷的急性炎性滲出損傷為主。而且,本研究發現肺組織形態、肺系數、MDA、SOD、KL-6與肺纖維化的關系均較密切,故而檢測百草枯中毒患者血清SOD、MDA和KL-6黏蛋白水平對判斷中毒程度、指導治療及評估預后有其意義。

綜上所述,KL-6黏蛋白參與著肺纖維化的全部發展過程。關于KL-6黏蛋白的測定存在十分重要的臨床意義,這能夠對肺纖維化的初始、發展以及其嚴重程度進行指導作用,進而對其相關治療以及判斷預后制定有價值的治療方案。