雌二醇通過雌激素β受體促進非小細胞肺癌A549細胞增殖

信 波,龐海林,申煒煒,張開亮,張 蕾,張立成,張賀龍*

(1解放軍第88醫院腫瘤科,泰安 271000;2空軍軍醫大學第二附屬醫院腫瘤科;3解放軍第88醫院骨科;*通訊作者,E-mail:cnxazhl@163.com)

肺癌是目前世界范圍內最常見的腫瘤,其引起的死亡占所有腫瘤導致死亡的20.6%[1]。肺癌的主要組織學類型是非小細胞肺癌(NSCLC),占所有肺癌的80%-85%[2]。

雌激素是人體內一類重要的類固醇性激素。它調節著體內眾多的生理功能,如細胞生長、繁殖、發育和分化。雌激素除了對正常的細胞和生理過程產生影響外,還在諸如腫瘤、代謝病、心血管疾病、神經退行性疾病、炎癥、骨質疏松等病理過程中發揮著極其重要的作用。雌激素主要通過雌激素受體(estrogen receptor,ER)發揮這些作用[3],而ER又分為ERα和ERβ兩類。

近年來,雌激素在肺癌發生發展中的作用受到了廣泛關注[4]。已有文獻報道,與正常肺細胞相比,NSCLC組織中存在有大量ER[5]。而人體內雌激素主要為雌二醇,因此,本實驗旨在探討雌二醇對人非小細胞肺癌細胞增殖能力的影響,為其臨床應用提供理論及實驗依據。

1 材料和方法

1.1 細胞株及主要試劑

人類非小細胞肺癌細胞系A549、H1299(購自中科院上海細胞生物研究所);RPMI 1640培養基、胎牛血清(Gibco,美國);E2(17β-雌二醇,Sigma,美國);PPT(雌激素受體α激動劑,TOCRIS,英國);DPN(雌激素受體β激動劑,TOCRIS,英國);MTT細胞增殖檢測試劑盒、結晶紫染色液(上海碧云天生物技術有限公司)。

1.2 細胞培養

常規使用RPMI 1640培養液(含10% FBS、100 U/ml青霉素和0.1 mg/ml鏈霉素)培養人非小細胞肺癌細胞系A549細胞和H1299細胞。每次取對數生長期的細胞進行實驗。

1.3 細胞增殖實驗

將A549細胞和H1299細胞分別用三種藥物(E2、PPT、DPN)各作用24 h和48 h。取生長至鋪滿瓶底80%左右的A549細胞和H1299細胞,常規消化;按每孔1 000個細胞的密度將細胞接種至96孔板,為了去除FBS中可能存在的激素所帶來的影響,待細胞貼壁后,換無血清培養基培養24 h,而后在96孔板內按濃度梯度(0,10-10,10-9,10-8,10-7,10-6mol/L)加入E2,按濃度梯度(0,10-8,10-7,10-6,10-5,10-4mol/L)加入PPT或DPN,每個濃度設立5個復孔;“十字形”晃動培養板,使細胞分布均勻,放入培養箱;加入相關試劑后的第24小時和48小時分別用MTT法檢測細胞的增殖情況,并分析得出的數據。

1.4 平板克隆形成實驗

將處于對數生長期的A549和H1299細胞用胰酶消化,重懸后制成單細胞懸液;于6孔板培養板中接種200個細胞/孔,每個實驗組3個復孔;將接種好的細胞于培養箱中繼續培養6 d,然后換無血清培養液培養24 h,而后在無血清培養液中加入相應濃度的E2、PPT和DPN培養24 h和48 h,然后換新鮮完全細胞培養液繼續培養5 d;肉眼可見克隆形成或鏡下可觀察到絕大多數單克隆中細胞數大于50個為止(中途每3 d進行換液并觀察細胞狀態)。每孔加入95%酒精1 ml,固定細胞20 min;PBS漂洗細胞1次;每孔加入1%結晶紫染液1 ml,染細胞15 min;將六孔板浸泡至流水中洗滌,直至洗凈板上背景,晾干;數碼相機拍照整張板,并對肉眼可見克隆進行計數。

1.5 細胞凋亡檢測

按每孔2×105個細胞的數量將細胞接種至六孔板中,待細胞貼壁后加入無血清培養液培養24 h;分別加入相應濃度的E2、PPT和DPN,繼續孵育48 h;收集1×105-5×105個細胞,加入500 μl結合緩沖液重懸細胞;加入5 μl Annexin Ⅴ-FITC混勻,再加入Annexin Ⅴ-FITC Propidim Iodin 5 μl;室溫避光反應5-10 min。1 h內用流式細胞儀檢測細胞凋亡情況。

1.6 細胞周期檢測

按每孔2×105個細胞的數量將細胞接種至6孔板,待細胞貼壁后加入無血清培養液培養24 h;分別加入相應濃度的E2、PPT和DPN,繼續孵育48 h;收集1×105-5×105個細胞;加入1 ml 70%冰乙醇,4 ℃固定12-24 h;1 000g離心5 min,棄上清;加入1 ml預冷過的PBS漂洗1次,1 000g離心5 min,棄去上清液,輕彈離心管底以分散細胞。管內加入500 μl碘化丙啶染色液,充分混勻,37 ℃避光反應30 min。4 ℃避光存放,于24 h內用流式細胞儀在400 nm處檢測。

1.7 統計學分析

使用SPSS 11.0統計學軟件進行分析。根據不同的數據類型,采取相應的統計學方法如方差分析、One-way ANOVA和Stutent’st檢驗,數據以平均值±標準差表示,P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 E2與DPN均可促進A549細胞增殖

為了排除完全培養基內血清中可能含有的激素對細胞生長的影響,在加入E2、PPT和DPN前24 h即用無血清培養基培養細胞,加入E2、PPT和DPN后繼續用無血清培養基培養細胞。由于細胞在無血清培養基中無法正常分裂生長,所以本實驗只觀察加入E2、PPT和DPN后48 h內(即無血清培養基培養細胞72 h)三者對細胞的影響。且以未添加相應試劑的無血清培養基為對照組。

本實驗觀察A549細胞和H1299細胞在不同濃度E2、PPT和DPN作用下增殖的變化時,結果顯示當E2濃度為10-8mol/L,作用48 h,可以促進A549細胞增殖(P<0.05,見圖1)。當PPT作用于A549細胞和H1299細胞24 h,在10-4mol/L和10-5mol/L高濃度下,兩種細胞幾乎全部死亡(P<0.05),可能由于藥物濃度較大時,其毒性作用導致了細胞的死亡;而當其濃度稀釋至10-6mol/L后,對增殖沒有明顯的影響(P>0.05,見圖2)。當DPN濃度處于10-6-10-8mol/L時,作用48 h,可以促進A549細胞增殖(P<0.05,見圖3)。表明雌激素及ERβ激動劑DPN對A549細胞增殖的促進作用具有濃度依賴性和時間依賴性。

與對照組相比,*P<0.05圖1 不同濃度的E2對A549細胞和H1299細胞增殖的影響Figure 1 The effect of E2 on proliferation of A549 and H1299 by MTT assay

2.2 雌激素及其α和β受體激動劑對肺癌細胞克隆形成能力的影響

根據已有的MTT實驗結果,并結合參考文獻,選擇E2、PPT、DPN的作用濃度均為10-8mol/L,以此作為給藥劑量,且以未添加相應試劑的無血清培養基為對照組。在接種細胞14 d后,對各組細胞形成的克隆進行計數,結果顯示:E2和DPN對A549細胞作用48 h,可以顯著提高細胞的克隆形成能力(P<0.05,見圖4)。而E2、PPT、DPN對H1299細胞的克隆形成能力沒有明顯的影響(P>0.05,見圖5)。表明E2和DPN均可提高A549細胞的克隆形成能力。

2.3 雌激素及其β受體激動劑對肺癌細胞凋亡和細胞周期的影響

通過上述實驗,我們發現在體外,E2和DPN均可以促進A549細胞的增殖,而E2、PPT和DPN對H1299細胞的增殖并未發揮明顯的促進作用。為進一步探索雌激素和DPN如何影響A549細胞增殖的機制,我們利用流式細胞儀分別檢測加E2和DPN后對A549細胞的凋亡和細胞周期的影響,以無血清培養基為對照組。

經統計學分析,E2和DPN并未影響A549細胞的凋亡,E2組、DPN組、對照組凋亡率分別為1.5%±0.8%,1.6%±0.6%,1.8%±0.5%,差異無統計學意義(P>0.05,見圖6)。E2和DPN可以使A549細胞處于G1期的比例減少,而處于S期的細胞比例增加,差異有統計學意義(P<0.05,見圖7,表1)。提示E2和DPN能夠促進細胞G1-S周期進程,提高細胞增殖能力。

與對照組相比,*P<0.05圖2 不同濃度的PPT對A549細胞和H1299細胞增殖的影響Figure 2 The effect of PPT on proliferation of A549 and H1299 by MTT assay

與對照組相比,*P<0.05圖3 不同濃度的DPN對A549細胞和H1299細胞增殖的影響Figure 3 The effect of DPN on proliferation of A549 and H1299 by MTT assay

與對照組相比,*P<0.05圖4 E2、PPT、DPN對A549細胞克隆形成能力的影響Figure 4 The effects of E2, PPT and DPN on colony forming abilities of A549 cells

圖5 E2、PPT、DPN對H1299細胞克隆形成能力的影響Figure 5 The effects of E2, PPT and DPN on colony forming abilities of H1299 cells

A. E2組 B. DPN組 C.對照組圖6 E2和DPN作用24h對A549細胞凋亡的影響Figure 6 Effects of E2 and DPN on apoptosis of A549 cells

A. E2組 B. DPN組 C.對照組圖7 E2和DPN促進A549細胞G1-S周期進程Figure 7 E2 and DPN promoted G1-S phase of A549 cell cycle

表1E2和DPN對A549細胞G1-S周期的影響

Table1EffectsofE2andDPNonG1-SphaseofA549cellcycle

組別G1期S期G2期E2組50.98±3.3?33.71±2.6?15.31±1.8 DPN組55.43±4.1?26.05±3.5?18.62±1.9對照組70.03±3.220.10±2.29.67±1.5

與對照組比較,*P<0.05

3 討論

雌激素是一類非常重要的甾體類性激素,通過與其不同的受體結合形成E2/ER復合物,從而促進機體的生長發育和維持多系統器官的功能。ER主要表達于子宮、腦、肝臟、卵巢、乳腺、男性生殖系統、肺以及骨骼組織。ER作為核受體蛋白超家族中的重要一員,主要和小分子疏水配體結合,主要包括ERα、ERβ兩種亞型[6]。

根據文獻報道,肺癌尤其是非小細胞肺癌,雌激素與其發生和進展緊密相關。與正常肺細胞相比,肺癌細胞含有大量的ER[7]。ERα和ERβ具有不同的組織分布。在正常的肺細胞和惡性肺細胞內都發現了ERβ。但是,ERα卻在正常肺細胞里很少存在,而是在肺癌細胞內大量存在[8]。雖然ERα和ERβ識別相似的靶DNA序列,對E2的應答也相似,但它們對DNA的親和力以及配體識別的特異性有所不同。而且在不同腫瘤中,發揮作用的ER也有所不同[9]。此外,在共表達ERα和ERβ的組織中,ERα的轉錄活性比ERβ略強,但ERβ具有減弱ERα的作用[10]。那么,雌激素在非小細胞肺癌細胞增殖中又是通過與哪個受體結合后發揮作用呢?

針對這一問題,本研究通過MTT實驗篩選出了雌激素(E2)、ERα激動劑(PPT)和ERβ受體激動劑(DPN)對肺癌細胞系A549和H1299的有效作用濃度和作用時間。結果顯示:E2和DPN可以促進A549細胞的增殖,而對H1299的增殖沒有影響。PPT在高濃度時,可嚴重抑制這兩種細胞的增殖,低濃度時則無明顯作用。平板克隆形成實驗的結果提示,E2及DPN促進A549細胞的增殖,而對H1299細胞不具有類似的作用;而PPT對兩種細胞的增殖無明顯的促進作用。流式細胞術結果提示E2和DPN通過促進細胞G1-S周期進程,提高細胞增殖能力。

綜上,E2是通過ER起作用,當ERβ被激活時,可以促進A549細胞增殖,而激活ERα對A549細胞則沒有任何相應的作用,所以本研究的結果提示E2激活ERβ后可促進A549細胞在體外的增殖。這為探索肺癌的發病機制以及尋找新的治療靶點提供了實驗依據。