Rev-erb激動劑GSK4112對心肌梗死大鼠心肌損傷和心臟重塑的影響

周中淑,傅春江,鄒 雪,唐 黎

(陸軍軍醫(yī)大學第三附屬醫(yī)院心血管內(nèi)科,重慶 400042;*通訊作者,E-mail:chunjiang510@sina.com)

心肌梗死是心血管疾病致死率最高的疾病之一[1]。心肌梗死是由于冠狀動脈狹窄或痙攣,導致心肌急性或持續(xù)性缺血缺氧,心肌細胞死亡。心肌梗死后,即使冠脈再通,心肌細胞數(shù)目亦減少,影響心臟的射血功能[2]。白介素-1β(IL-1β)和腫瘤壞死因子-α(TNF-α)等多種促炎癥細胞因子均參與心肌重塑[3]。Rev-erb為核受體家族的成員,研究發(fā)現(xiàn)其具有調(diào)節(jié)生物機體組織代謝的作用。Rev-erb家族的蛋白C端缺乏能和配體結(jié)合的結(jié)構(gòu)域[4],但是可以通過招募核受體阻抑因子和組蛋白去乙酰化酶3等來抑制Rev-erb蛋白的表達。組蛋白去乙酰化酶3是一種Rev-erb激動劑,是小分子化學探針[5]。黃國棟[6]研究發(fā)現(xiàn)Rev-erba和per1b對斑馬魚自噬基因的節(jié)律性具有重要的調(diào)控作用。Fontaine等[7]首先報道了Rev-erb和炎癥之間具有相關(guān)性,Rev-erb能抑制Tlr4的表達,從而控制炎癥信號。國外學者研究發(fā)現(xiàn),在人類巨噬細胞中,用藥理學方法增加Rev-erb的mRNA表達量后直接導致促炎癥因子白細胞介素6的mRNA表達量下降[8-10]。本研究擬采用Rev-erb激動劑GSK4112處理心肌梗死大鼠,觀察其對大鼠的心肌損傷和心臟重塑的影響,并探討作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

10周齡雄性SPF級Wistar大鼠48只(第三軍醫(yī)大學實驗動物中心 生產(chǎn)許可證號:270M2),體質(zhì)量(300±40)g。大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d(從購買時算起),隨機分為假手術(shù)對照組(n=11)、假手術(shù)給藥組(n=13)、實驗對照組(n=12)和實驗給藥組(n=12)。假手術(shù)對照組和假手術(shù)給藥組大鼠全部存活。實驗對照組和實驗給藥組在結(jié)扎左冠狀動脈前降支后分別有3只和2只大鼠死亡。

1.2 心肌梗死造模方法

兩組大鼠均采用腹腔注射3%戊巴比妥鈉麻醉,沿左側(cè)肋間切開胸廓。實驗組,應(yīng)用冠狀動脈結(jié)扎建立心肌梗死模型[11]。假手術(shù)組僅切開胸廓和心包,不做結(jié)扎。模型建立成功后,飼養(yǎng)7 d后。實驗組隨機分為實驗給藥組和實驗對照組,假手術(shù)組隨機分為假手術(shù)給藥組和假手術(shù)對照組;實驗給藥組和假手術(shù)給藥組連續(xù)每日2次皮下注射REV-ERB激動劑GSK4112(杭州昊鑫生物科技股份有限公司)100 μg/kg,實驗對照組和假手術(shù)對照組同時注射相同量的生理鹽水。冠狀動脈結(jié)扎是最常選用的大鼠心肌梗死造模方法,其具體操作步驟為:將大鼠用氯氨酮麻醉后接上小動物呼吸機,經(jīng)左側(cè)第4肋間剪開皮膚,鈍性分離肌肉組織,打開胸腔并剪開心包膜,擠壓出心臟,在左心耳與肺動脈圓錐之間穿線,結(jié)扎左冠狀動脈前降支(于分支的起點處約1-2 mm),用Ⅱ?qū)碛涗泝x記錄心電圖。

1.3 心肌梗死面積和梗死壁厚度的檢測

在造模后2 h取標本,采用腹腔注射戊巴比妥鈉麻醉四組大鼠,然后取出心臟,分離心房及右心室。采用10%甲醇溶液固定后,石蠟切片(厚度5 μm),馬松三色染色。從每個心臟的切片中隨機選取三張,測量梗死面積和梗死壁厚度。其中心臟梗死面積的計算采用梗死壁的表面積占整個LV表面積比值進行表征。梗死壁的厚度即為梗死最薄區(qū)域厚度。

1.4 采用TUNEL染色檢測心肌細胞凋亡

采用TUNEL染色陽性率表征心肌細胞凋亡情況,測定方法參照TUNEL試劑盒操作說明進行[12],凋亡心肌細胞在熒光顯微鏡下呈綠色。每個心臟中隨機選取10張組織切片,隨機選取每張切片中的5個視野,觀察記錄TUNEL陽性細胞數(shù)。按照下列公式計算得到心肌細胞的凋亡指數(shù)(%):

凋亡指數(shù)(%)=(心肌細胞核TUNEL陽性細胞數(shù)/視野內(nèi)心肌細胞總數(shù))×100%。

1.5 采用血管新生標志物CD31檢測梗死邊緣區(qū)血管新生情況

將隨機選取10張心肌梗死組織切片,放入載玻片干燥后脫蠟[13]。采用40×EDTA抗原修復液進行修復后,用3%BSA封閉。然后采用1 ∶100稀釋的CD31抗體孵育過夜。PBS緩沖液漂洗后,以1 ∶200稀釋Cy3熒光抗體孵育1 h后漂洗3次。熒光封片劑封片后,顯微鏡觀察5個視野并記錄CD31陽性數(shù)目。

1.6 心臟重塑指標檢測

測定左室短長軸之比(D/L),左室舒張末期內(nèi)徑(LVEDd),室間隔厚度(IVST),左室后壁厚度(LVPWT),從而按照下列公式計算得到左室心肌質(zhì)量(LVM)及其指數(shù)(LVMI)[14]:

LVM(g)=1.04×[(LVEDd+LVPWT+IVST)3-LVEDd3]-13.6;

LVMI=(g/m2)=LVM/體表面積(BSA)。

1.7 檢測心臟血清中IL-1β、IL-6和TNF-α三項炎癥因子水平

血清IL-1β的檢測采用雙抗體放免法檢測,血清IL-6的檢測采用雙抗體夾心ELISA法檢測,血清TNF-α的檢測采用雙抗體夾心ELISA法檢測。檢測均按照試劑盒檢測方法進行,試劑盒均購自南京建成科技有限公司。

1.8 統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果

2.1 心肌梗死面積

假手術(shù)對照組和假手術(shù)給藥組在解剖后，均未發(fā)現(xiàn)心肌梗死現(xiàn)象(見圖1)。實驗對照組心肌梗死位置為前間壁，梗死面積為(51.32±2.40)%；而實驗給藥組心肌梗死位置為前間壁，梗死面積為(43.96±1.75)%，低于實驗對照組，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，說明REV-ERB激動劑GSK4112能夠降低心肌梗死大鼠的心肌梗死面積。

圖1 大鼠心肌梗死面積Masson染色圖Figure 1 Masson staining of myocardial infarction area in rats with different treatments

2.2 心室壁梗死厚度的檢測

假手術(shù)對照組和假手術(shù)給藥組在解剖后，均未發(fā)現(xiàn)心肌梗死現(xiàn)象，因此并無梗死壁。實驗對照組心肌梗死壁厚度為(0.38±0.01)mm；而實驗給藥組心肌梗死壁厚度為(0.54±0.02)mm，高于實驗對照組，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，說明REV-ERB激動劑GSK4112能夠增加心肌梗死大鼠的心肌梗死壁厚度。

2.3 室間壁心肌細胞凋亡情況

假手術(shù)對照組和假手術(shù)給藥組大鼠心肌細胞只有少量細胞凋亡，凋亡率分別為(0.79±0.08)%和(0.81±0.06)%，兩組間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。實驗對照組和實驗給藥組的心肌細胞凋亡率高于假手術(shù)對照組和假手術(shù)給藥組，說明模型建立成功。實驗對照組心肌細胞凋亡率高達(6.02±0.57)%；而實驗給藥組細胞凋亡率降低為(3.79±0.21)%，低于實驗對照組，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。說明REV-ERB激動劑GSK4112能夠降低心肌梗死大鼠的心肌細胞凋亡率。

圖2 大鼠的心肌細胞凋亡流式細胞結(jié)果Figure 2 Apoptotic rate of cardiac myocytes in rats by flow cytometry

2.4 梗死邊緣區(qū)血管新生情況

為了明確Rev-erb激動劑GSK4112能否通過促血管新生改善心肌梗死后對心臟缺血性損傷和心臟重塑，采用新生血管標志物CD31反映血管新生情況，并進行定量分析。假手術(shù)對照組和假手術(shù)給藥組大鼠并未發(fā)生心肌梗死和心肌損傷，因此并未發(fā)現(xiàn)血管新生情況。實驗對照組心肌梗死邊緣區(qū)血管密度為31.65±2.38，實驗給藥組心肌梗死邊緣區(qū)血管密度為48.96±3.55，兩組間差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。說明Rev-erb激動劑GSK4112在大鼠機體內(nèi)具有成血管功能，因此能夠改善心肌梗死后心肌缺血損傷。

2.5 心臟重塑指標

假手術(shù)對照組和假手術(shù)給藥組的左室短長軸之比(D/L)、左室舒張末期內(nèi)徑(LVEDd)、室間隔厚度(IVST)、左室后壁厚度(LVPWT)、左室心肌質(zhì)量(LVM)及其指數(shù)(LVMI)間均差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05，見表1)。實驗對照組的D/L、LVEDd、LVPWT、LVM和LVMI均高于假手術(shù)對照組和假手術(shù)給藥組(P<0.05，見表1)。實驗各組IVST與假手術(shù)各組均差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05，見表1)。實驗給藥組的D/L、LVEDd、LVPWT、LVM和LVMI均低于實驗對照組(P<0.05，見表1)。而實驗給藥組的D/L、LVEDd和LVM均高于假手術(shù)對照組和假手術(shù)給藥組(P<0.05)，LVPWT和LVMI則恢復至假手術(shù)組大鼠水平，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05，見表1)。以上結(jié)果說明Rev-erb激動劑GSK4112能夠顯著改善心肌梗死大鼠的心臟重塑指標，阻止心肌重塑。

2.6 炎癥因子水平

假手術(shù)對照組和假手術(shù)給藥組的炎癥因子IL-1β、IL-6和TNF-α水平均差異無統(tǒng)計學意義。實驗對照組炎癥因子IL-1β、IL-6和TNF-α水平均高于假手術(shù)對照組和假手術(shù)給藥組(P<0.05,見表2)。相對于實驗對照組,實驗給藥組炎癥因子IL-1β、IL-6和TNF-α水平均減低(P<0.05),但仍高于假手術(shù)對照組和假手術(shù)給藥組(P<0.05,見表2)。說明REV-ERB激動劑GSK4112可抑制心肌梗死后的炎癥反應(yīng)。

分組D/LLVEDd(cm)IVST(cm)LVPWT(cm)LVW(g)LVMI(g/m2)假手術(shù)對照組0.45±0.094.15±0.280.93±0.061.04±0.08176.4±19.593.5±9.2假手術(shù)給藥組0.48±0.094.08±0.300.98±0.051.11±0.17169.2±15.894.1±8.9實驗對照組 0.79±0.09?6.83±0.52?0.94±0.071.48±0.13?325.3±20.5? 168.5±8.8?實驗給藥組 0.61±0.05?#5.21±0.35?#0.97±0.091.16±0.10?229.1±10.3?# 109.3±10.5?

與假手術(shù)對照組比較,*P<0.05;與實驗對照組比較,#P<0.05

分組 IL-1β IL-6TNF-α 假手術(shù)對照組11.7±0.9109.3±9.112.4±1.1假手術(shù)給藥組10.6±0.9112.7±8.911.2±0.8實驗對照組 19.5±1.2?312.9±10.2?32.9±2.2?實驗給藥組 13.7±1.1?#205.6±9.4?#23.6±1.7?#

與假手術(shù)對照組比較,*P<0.05;與實驗對照組比較,#P<0.05

3 討論

近現(xiàn)代醫(yī)學研究發(fā)現(xiàn),機體發(fā)生心肌梗死后會出現(xiàn)心肌功能喪失,進而導致存活的心肌缺血,因此心肌梗死會逐漸延伸,心肌功能下降[15],出現(xiàn)心臟重塑。研究證實,心臟重塑機會越多,心肌梗死后患者存活率越低[16]。因此阻止心肌梗死后的心臟重塑,對于提高患者的生存率具有極其重要的意義。心肌梗死后,大量的中性粒細胞和單核細胞聚集浸潤造成的炎癥會阻塞血管并釋放氧自由基,造成內(nèi)皮細胞損傷,從而導致心肌缺血損傷和缺血再灌注損傷[17]。此時腫瘤壞死因子TNF-α的mRNA過度表達,血清中TNF-α含量上升,引發(fā)機體心肌細胞的凋亡[18]。高度表達的白介素(IL)會通過改變血管內(nèi)皮細胞表型,造成炎性細胞傾向于滲透至血管外。此時活化的核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB可以通過誘導TNF-α和IL等炎癥因子的表達,造成心肌炎癥損傷。因此,若能夠抑制核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB的活化,降低炎癥因子IL-1β、IL-6和TNF-α水平,有助于改善心肌缺血性損傷[19,20]。

本研究顯示,模型建立后假手術(shù)對照組11只大鼠在術(shù)后全部存活,假手術(shù)給藥組也全部存活。實驗對照組和實驗給藥組在結(jié)扎左冠狀動脈前降支后分別有3只和2只死亡。假手術(shù)對照組和假手術(shù)給藥組在解剖后,均未無心肌梗死現(xiàn)象。而實驗給藥組心肌梗死面積、細胞凋亡率、D/L、LVEDd、LVPWT、LVM、LVMI和炎癥因子IL-1β、IL-6、TNF-α水平均低于實驗對照組(P<0.05),高于假手術(shù)對照組和假手術(shù)給藥組(P<0.05)。實驗給藥組心肌梗死壁厚度和心肌梗死邊緣區(qū)血管密度均高于實驗對照組(P<0.05),低于假手術(shù)對照組和假手術(shù)給藥組(P<0.05)。該結(jié)果說明Rev-erb激動劑GSK4112能夠抑制心肌梗死后大鼠機體內(nèi)炎癥因子IL-1β、IL-6和TNF-α的mRNA的表達,降低炎癥因子含量,從而降低心肌梗死大鼠的心肌細胞凋亡率。另外Rev-erb激動劑GSK4112在大鼠機體內(nèi)具有成血管功能。從而降低心肌梗死大鼠的心肌梗死面積、增加心肌梗死大鼠的心肌梗死壁厚度、改善心肌梗死后心肌缺血損傷、阻止心肌重塑。

綜上所述,Rev-erb激動劑能夠通過降低炎癥因子的含量產(chǎn)生抗炎作用,進而改善心肌梗死后的心肌缺血性損傷和抑制心臟重塑。