吉西他濱聯(lián)合順鉑調(diào)控mTOR/S6K1/NF-κB信號治療乳腺癌的機制研究

左一凡 高立偉 武素芳 閆江濤

乳腺癌是我國女性常見的發(fā)生在乳腺腺上皮組織的惡性腫瘤，近年來其發(fā)病率在世界范圍逐年上升[1]。乳腺癌的病因尚不明確，其發(fā)生可能與家族性遺傳、環(huán)境污染或激素不當使用等因素有關[2-3]。乳腺并不是維持機體生命活動的重要器官，因此，女性原位乳腺癌并不致命；但乳腺癌細胞容易脫落，游離的乳腺癌細胞可以隨血液或淋巴液播散轉移至全身，嚴重危及女性身心健康和生命。吉西他濱和順鉑作為主要的抗乳腺腫瘤化療藥物，可以誘導乳腺癌細胞的凋亡和分化，參與調(diào)節(jié)多種途徑腫瘤的發(fā)生和發(fā)展過程[4-5]，但吉西他濱和順鉑聯(lián)合應用是否可以通過調(diào)節(jié)mTOR/S6K1/NF-κB信號通路誘導癌細胞凋亡以診治原發(fā)性乳腺癌的研究未見報道。本研究主要采用免疫組織化學(SP法)、ELISA法及PCR等方法檢測乳腺癌患者活檢標本中mTOR/S6K1/NF-κB信號通路相關蛋白的表達，探討吉西他濱和順鉑聯(lián)合應用調(diào)節(jié)mTOR/S6K1/NF-κB信號通路治療女性原發(fā)性乳腺癌的作用。

1 材料與方法

1.1 一般資料

選取本院2016年3月至2017年5月收治的150例女性原發(fā)性乳腺癌患者，經(jīng)病理學確診。經(jīng)本院倫理委員會同意，患者自愿接受臨床檢查，并簽署了知情同意書。患者平均發(fā)病年齡為(48.21±5.65)歲。患者臨床分期：Ⅰ期45例，Ⅱ期58例，ⅢA期47例；絕經(jīng)前78例，絕經(jīng)后72例；浸潤性導管癌103例，導管內(nèi)癌伴灶性浸潤47例。

乳腺癌患者接受吉西他濱1 000 mg/m2靜脈滴注化療，每周1次，連續(xù)3周給藥為1個治療周期(吉西他濱購于齊魯藥業(yè)有限公司，國藥準字H20113286，商品規(guī)格：1.0 g/支，批號：20161129)。順鉑按體表面積一次75 mg/m2，每3周1次，連續(xù)給藥4次為1療程(注射用順鉑購于齊魯制藥廠，國藥準字H37021356，商品規(guī)格：30 mg/支，批號:160315)。

1.2 療效診斷

依據(jù)實體瘤療效評價標準(RECIST)評定化療藥物的臨床療效。在化療前后1周內(nèi)分別測量患者乳房腫塊的大小，及雙腋雙鎖骨上淋巴結等轉移情況，用于評估化療療效。療效分為完全緩解(complete remission,CR)、部分緩解(partial remission,PR)、穩(wěn)定(stable disease,SD)及進展(progressive disease,PD)。

1.3 免疫組織化學法檢測mTOR、S6K1和NF-κB的蛋白表達水平

取乳腺癌患者的病理石蠟切片標本，5%血清進行封閉40 min(室溫)，分別加入1∶1000的mTOR、S6K1和NF-κB單克隆抗體孵育，4 ℃過夜。隔天復溫后，加入二抗37 ℃ 30 min孵育，PBS清洗3次，加入SP后進行40 min恒溫反應后進行DAB顯色，中性樹膠封片后用10×、40×物鏡顯微鏡進行觀察。陽性表達mTOR、S6K1和NF-κB的主要表現(xiàn)是棕黃色顆粒在細胞內(nèi)出現(xiàn)。在40×顯微鏡下隨機觀察5個高倍視野，計算組織中mTOR、S6K1和NF-κB蛋白表達的平均光密度(mean density)。平均光密度=累積光密度(IOD)與面積(area)的比值，用于反映組織中mTOR、S6K1和NF-κB蛋白的表達含量。

1.3.1 Real-Time PCR檢測mTOR、S6K1和NF-κB mRNA表達含量 采用Real-time PCR法對mTOR、S6K1和NF-κB mRNA表達進行檢測。Trizol法提取乳腺癌組織中的總RNA，轉錄合成cDNA進行Real-time PCR操作。實驗采用相對定量法，采取閾值循環(huán)數(shù)(cycle threshold,CT)值比較法，計算不同樣本之間的相對百分比。公式:ΔΔCt=(CT實驗組的基因-CT實驗組管家基因)-(CT對照組目的基因-CT對照組管家基因)。目的mRNA的量=2-ΔΔCT。

1.3.2 Western Blot檢測蛋白mTOR、S6K1和NF-κB含量 取乳腺癌組織冰上裂解2 h，離心后用BCA試劑盒進行蛋白濃度檢測，將各組蛋白濃度總量調(diào)整為30 μg/ul。將各組蛋白樣品加入到10% SDS聚丙烯酰胺凝膠中進行電泳，轉膜至PVDF膜后按1∶1000的稀釋比例加入mTOR、S6K1和NF-κB和二抗。用ECL顯色劑顯色，用Bio-Pro凝膠成像分析儀掃描條帶成像，并用Quantity-one軟件對各組蛋白泳道條帶進行灰度掃描分析，計算得出相應蛋白表達量。

1.3.3 ELISA檢測患者p65、BCL-2和Caspase 3含量

取乳腺癌組織冰上裂解2 h，分離蛋白并低溫離心2 000 rpm/min 15 mim，取蛋白上清液待檢。采用酶聯(lián)免疫吸附測定法檢測患者血清p65、BCL-2和Caspase 3含量，嚴格按照說明書步驟操作，酶標儀測定波長450 nm處OD值。

1.4 統(tǒng)計學處理

數(shù)據(jù)采用SPSS 22.0軟件處理，計量資料結果用均數(shù)±標準差表示，組間差異采用t檢驗，計數(shù)資料差異采用卡方檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 療效診斷

乳腺癌患者應用吉西他濱和順鉑化療后，完全緩解6例(4.00%)、部分緩解73例(48.67%)、穩(wěn)定42例(28.00%)及進展29例(19.33%)，總有效率為52.67%。此外，與化療前相比，應用吉西他濱和順鉑化療后患者血清CA15-3、CA125和NSE水平均降低，且差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，而CEA水平化療前后的差異無統(tǒng)計學意義，見表1。

2.2 mTOR、S6K1和NF-κB免疫組織化學結果

乳腺癌患者應用吉西他濱和順鉑化療前后mTOR、S6K1和NF-κB蛋白免疫組化染色強度具有明顯的差異(P<0.05)。吉西他濱和順鉑化療后乳腺癌組織中mTOR、S6K1蛋白表達顯著降低，NF-κB蛋白表達顯著上升，有統(tǒng)計學差異(P<0.05)。見表2。

表1 乳腺癌患者應用吉西他濱和順鉑化療前后相關腫瘤標志物水平比較

表2 免疫組化分析蛋白表達水平變化

2.3 mTOR、S6K1和NF-κB mRNA表達含量

與化療前乳腺癌組織相比，吉西他濱和順鉑化療后乳腺癌組織中mTOR、S6K1mRNA表達含量顯著降低，NF-κBmRNA表達含量顯著上升，具有明顯的統(tǒng)計學差異(P<0.05)，見圖1。

圖1 乳腺癌組織中mRNA的表達

2.4 mTOR、S6K1和NF-κB蛋白含量檢測結果

與化療前乳腺癌組織相比，吉西他濱和順鉑化療后乳腺癌組織中mTOR、S6K1蛋白含量顯著降低，NF-κB蛋白含量顯著上升，具有明顯的統(tǒng)計學差異(P<0.05)，見圖2。

圖2 蛋白含量檢測結果

2.5 ELISA檢測p65、BCL-2和Caspase 3結果

ELISA結果顯示，化療后乳腺癌患者p65和Caspase 3表達含量具有顯著增加(P<0.05)，BCL-2的表達量顯著降低，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表3。

表3 ELISA檢測細胞因子含量變化

3 討論

吉西他濱作為一種影響核酸合成的抗代謝類抗腫瘤藥物，對晚期乳腺癌或復發(fā)乳腺癌均有一定的療效，且抗藥耐藥性良好，被中國抗癌協(xié)會推薦為晚期乳腺癌單藥化療或聯(lián)合化療的一線方案藥物[6-7]。順鉑是一種重金屬絡合物，主要功能為抑制DNA的復制過程。當順鉑進入細胞后，作用在DNA的嘌呤和嘧啶堿基，通過抑制癌細胞的DNA復制過程損傷其細胞膜上結構導致細胞裂解死亡，該品能與DNA結合，引起交叉聯(lián)結，從而破壞DNA的功能，并抑制細胞有絲分裂，進而抑制癌細胞的增殖[8-9]。

mTOR 又稱雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)，屬于磷脂酰肌醇激酶相關激酶(phospha-tidy-linosito kinase-related kinase,PIKK)蛋白家族成員。mTOR 接受細胞信號轉導因子的調(diào)節(jié)，通過細胞調(diào)節(jié)劑如 p70 S6K 和 4E-BP1 等來調(diào)控細胞內(nèi)蛋白的合成和細胞生長等過程[10-11]。mTOR 下游信號通路靶分子核糖體 S6 蛋白激酶(S6 kinase,S6K)是一種絲/蘇氨酸蛋白激酶，mTOR 通過直接或間接調(diào)控S6K 中的多個磷酸化位點并激活 S6K，來調(diào)控下游的細胞轉導信號通路NF-κB[12-13]。NF-κB被激活后導致IKB蛋白磷酸化，NF-KB得到釋放，進入細胞核與核基因啟動子/增強子上的特異性的kB位點結合，激活并促進二聚體p50/p65活化，激活后可密切參與凋亡基因的轉錄調(diào)控及細胞凋亡的過程，這最終導致了效應性Caspase 3活化，胞核內(nèi)DNA鏈斷裂，細胞結構的全面解體細胞死亡發(fā)生[12-15]。

給予乳腺癌患者吉西他濱聯(lián)合順鉑治療后，治療總有效率為52.67%，說明聯(lián)合化療對患者有一定的治療作用。免疫組化、WesternBlot和Real-Time PCR結果表明，給予乳腺癌患者應用吉西他濱聯(lián)合順鉑治療后，乳腺癌患者體內(nèi)mTOR、S6K1蛋白和mRNA表達顯著降低，NF-κB 蛋白和mRNA表達顯著上升，說明mTOR/S6K1/NF-κB信號通路被激活，積極參與吉西他濱聯(lián)合順鉑的藥物治療過程。ELISA結果顯示，化療后乳腺癌患者p65和Caspase 3表達含量具有顯著增加，BCL-2的表達量顯著降低，說明患者給予化療藥物治療后，乳腺癌組織相關信號通路被激活，細胞凋亡發(fā)生明顯，參與吉西他濱聯(lián)合順鉑誘導乳腺癌細胞的凋亡過程，有效促進癌細胞的裂解死亡。

綜上所述，mTOR/S6K1/NF-κB信號通路與乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展和治療效果密切相關，可以有效作為乳腺癌的治療新靶點。吉西他濱聯(lián)合順鉑可有效控制乳腺癌的疾病發(fā)展，具有一定的臨床治療效果。