TGF-β1/Smads信號通路在放射性心肌纖維化中的作用

敖碧鳳 羅 蘭 蘇勝發綜述 歐陽偉煒 盧 冰審校

放射治療是胸部惡性腫瘤如乳腺癌、霍奇金淋巴瘤、肺癌與食管癌等的主要治療方式之一，在腫瘤放射治療期間，位于胸部的心臟會不免受到照射，從而導致不同程度的損害[1]，其臨床表現有心包疾病、冠狀動脈損傷、心臟傳導系統異常、心臟瓣膜功能障礙、心肌梗死、心肌纖維化等，統稱為放射性心臟損傷(radiation-induced heart disease，RIHD)[2-4]。RIHD自1960年首次報道以來越來越受到關注，其中心肌纖維化是RIHD突出的晚期病理變化，常發生在放療后數年，會造成心臟重塑、心功能破壞和心臟衰竭等，嚴重影響患者生存及生活質量，但目前針對放射性心肌纖維化臨床尚缺乏有效的干預措施，且對其發病機制也不清楚[5-7]。一般認為多數細胞、因子及信號通路參與RIHD心肌纖維化的形成，包括成纖維細胞增多、微血管內皮損害、轉化生長因子-β1(TGF-β1)信號轉導等互相作用。目前關于TGF-β1/Smads信號通路與放射性心臟損傷心肌纖維化發生的相關性研究較多，TGF-β1被認為是放射性心肌纖維化產生過程中1個主要的發展因子，并參與RIHD發生發展的全過程[8]。

1 RIHD病理學改變及相關機制

RIHD的初期病理變化為微血管內皮損害，導致管壁增厚、管腔狹窄、血管閉塞、微循環阻滯、局部缺血等變化，這些變化增大了細胞膜通透性，使細胞內環境發生紊亂，從而誘導心肌細胞退變、心臟組織缺血最終形成纖維化組織[9]。Stewart等[10]報道放射性心臟損傷病理改變存在多樣性。心包滲出、心肌損害、心內膜滲出、冠狀動脈損害、瓣膜損害、傳導系統損害、心肌纖維化等不同病理表現都可見于放射性心臟損傷過程中[11-12]，且不同時期以某型病理改變為主合并其他類型[13]，其中心肌纖維化是RIHD突出的晚期病理表現，是放射遲發損傷的主要形式，也是RIHD的主要危害[14]。

放射性心肌纖維化實際上是心肌膠原合成增多而降解減少的漸進性過程，包含膠原成分的轉變以及心肌成纖維細胞(cardiac fibroblasts，CFs)的增加，跟一般心肌纖維化發生的過程近似。即心肌成纖維細胞成熟后會轉化為肌成纖維細胞，然后使內皮細胞增殖和膠原沉積增加，同時使細胞外基質沉積也增加，從而發生纖維化。但在照射條件下，心臟受損發生纖維化速度會加快，其原因心肌成纖維細胞受照射后，其生物學特性會發生轉變，容易轉化為肌成纖維細胞，而肌成纖維細胞較心肌成纖維細胞更容易合成心肌膠原，從而加速纖維化產生，導致后期心臟不同結構組織的病理性改變[15-16]。迄今為止關于RIHD心肌纖維化機制的研究有細胞實驗、動物實驗和臨床3個層次的研究，其中動物實驗和細胞實驗兩個層次的研究較多，但仍未有確切的結果，就目前關于RIHD心肌纖維化發生的可能相關機制研究概括如下：①心臟微循環損傷；②活性氧及氧化應激；③內質網功能障礙；④線粒體損傷；⑤細胞因子及其信號通路，研究較多的是TGF-β信號轉導通路，認為TGF-β1是參與形成放射性心肌纖維化過程中1個主要的生長因子[8]。⑥其他可能相關機制，如肥大細胞、RAS等。RIHD心肌纖維化的發生發展涉及眾多因素，但其主要集中在細胞因子信號通路方面，故對細胞因子信號通路所致RIHD心肌纖維化機制的研究可能會為臨床干預RIHD心肌纖維化發現治療靶點。

2 TGF-β超家族及Smads蛋白

2.1 TGF-β超家族

轉化生長因子β超家族是1類主要參與調節細胞的生長、分化以及多種病理、生理過程的蛋白多肽生長因子，具有多種生物學效應。其家族成員包含有60多個，包括生長轉化因子β、活化素、抑制素、骨形成蛋白等，他們都是多效應調節因子，對細胞分化、遷移等起重要的調節作用[17]。其中生長轉化因子β(transforming growth factor-beta,TGF-β)包括：TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3，其TGF-β1是細胞內蛋白家族成員TGF-β蛋白中含量最豐富的，也是誘導器官纖維化形成最緊密相連的細胞因子[18]。TGF-β1發揮作用主要通過其細胞受體系統介導，TGF-β1受體是1類存在于細胞表面上的跨膜糖蛋白分子，主要有五種不同的類型(TβRⅠ～Ⅴ型)。其中Ⅰ型Ⅱ型含有細胞傳遞所必需的絲氨酸(Ser)/蘇氨酸(Thr)激酶結構，故是目前研究最為普遍的細胞信號傳遞受體。TGF-β1激活后先后通過結合Ⅱ型受體和Ⅰ型受體將細胞信號傳遞到下游介質。Ⅲ型受體雖然屬于輔助性受體，但具有結合型和游離型兩種類型，且作用不同，結合型受體能增加Ⅰ型受體與TGF-β1的親和力，而游離型受體卻阻止TGF-β1與靶點的結合[19]。Ⅳ、Ⅴ型受體的主要作用目前尚未有確切的研究結果。TGF-β1主要生物學功能有：①增加膠原合成；②促進組織修復；③調節細胞外基質；④表達纖維蛋白，促成纖維化。

2.2 Smads蛋白

Smads家族蛋白是TGF-β信號通路的下游信號傳遞分子，主要負責將TGF-β信號從細胞膜傳遞到細胞核，故在細胞表面受體至細胞核的信號轉導過程中占主導地位，并且不同的TGF-β家族成員的信號轉導由不同Smads蛋白所傳遞。Smads蛋白在哺乳動物身上有8種，因為其結構和功能的不同，又分為3個亞家族，受體調節Smads蛋白(receptor regulated smads，R-Smads)：通過I型受體激活，并與之形成暫時復合物，其中包含在TGF-β信號系統轉導過程中緊密相關的Smad2、3，和被骨形成蛋白(BMP)信號活化的Smad1、5、8；共同介質型Smads蛋白(common partner smads，Co-Smads)：包含Smad4，是TGF-β家族成員信號傳導過程中共同的信號傳遞分子；抑制性Smads蛋白(inhibitory smads，I-Smads)：包含Smad6和Smad7，在TGF-β1信號系統轉導過程中起抑制作用。當Smad2或Smad3磷酸化后，便會與Co-Smads組成復合物，引起參與纖維化形成的轉錄因子和蛋白的表達，而I-Smads則會競爭性的同Smad2或Smad3結合TGF-β1型受體或者Co-Smads，加以阻止Smad2或Smad3的磷酸化，抑制TGF-β1/smads信號通路轉導[20-21]。Santibanez 等報道Smad2或Smad3能被經過Smad錨著蛋白(smad anchor for recept activation，SARA)激活的TβR-Ⅰ特定的識別和磷酸化，然后從SARA上解離并和Smad4形成復合物轉移至核內，參與調節基因轉錄[22]。

TGF-β1可激活多個信號通路，其下游主要作用通路是Smads通路。TGF-β大多以前體形式存在于細胞內，通過血管緊張素II(AngII)、活性氧(reactive oxygen species，ROS)等作用被激活，激活后的TGF-β最初結合TβR-Ⅱ形成復合物，然后再結合TβR-Ⅰ并使之磷酸化和激活，被活化的TβR-Ⅰ使其下游信號分子R-Smads磷酸化。磷酸化后的R-Smads與Co-Smads形成復合物，進入細胞核，參與基因轉錄。而I-Smads會阻礙R-Smads的磷酸化及Smads異源復合物的產生加以負調控TGF-β信號通路的轉導。。

3 TGF-β1/smads信號通路與RIHD心肌纖維化

TGF-β1是目前已知的典型的促纖維化細胞生長因子[23]，可調節細胞生長、分化，促進細胞增殖、抑制炎癥等，也同樣在心肌纖維化過程中扮演著重要的角色。最早1999年一項SD大鼠實驗顯示心臟局部照射后TGF-β1升高，但其與纖維化在時間上不一致[24]。此后越來越多的研究發現TGF-β1與RIHD心肌纖維化有緊密聯系。體內實驗證明，TGF-β1在心臟等重要臟器受照射后形成的纖維化過程中有重要作用[25-26]。體外細胞實驗也發現TGF-β1能誘導纖維母細胞增殖促成纖維化[23]。Boerma等[27]單次15Gy照射大鼠心肌細胞，發現TGF-β1在照射后的4 h及48 h表達都增加，表明TGF-β1參與放射性心臟損傷的發生。Sridharan等[28]建立18Gy劑量照射的大鼠模型，然后通過鹽酸扎利羅登增加大鼠TGF-β1 循環水平，發現心肌內膜下明顯纖維化形成，證明TGF-β1參與放射性心肌纖維化過程及心肌重構。Liu等[29]用20Gy劑量局部照射大鼠心臟后，發現TGF-β1在心肌組織的表達增加，膠原纖維含量也增多，表明TGF-β1促進心肌纖維化。王祎等[30]通過研究54例胸部腫瘤患者，檢測放療后患者血清TGF-β1值升高，表明TGF-β1和急性放射性心臟損傷存在關聯性。

Smads是TGF-β1信號轉導系統下游通路中重要的細胞內蛋白分子，通過將TGF-β1信號從細胞表面傳遞到細胞核，從而使編碼膠原合成的靶基因激活[31-32]，促進成纖維細胞增殖和膠原沉積，加快心肌纖維化生長。在心臟重塑和心力衰竭進展中TGF-β亞組激活Smads可引起心肌纖維化及心肌細胞凋亡，Smads蛋白表達升高均可出現在多種心臟病理生理狀態下，對心肌細胞產生致命性影響，因而在心肌纖維化中的作用日益受到重視。Yano等[33]研究用射線照射小鼠成纖維細胞，活化Smads通路能促進TGF-β1和COL-1基因的表達，表明TGF-β1/Smads通路的活化在心肌重構和輻射所致纖維化過程中有重要作用。研究發現Smad3信號通路對許多促纖維化因子(如：TGF-β1)產生應答，成為纖維化發生過程中的重要信號通路，在細胞外基質成分的合成中也起著重要作用[34-35]。徐旺等[36-37]通過研究發現Smad3在肥厚心肌中表達顯著增加，TGF-β1通過激活Smad3加速心肌間質纖維化過程，表明TGF-β/Smad3通路參與心肌纖維化的形成。

綜上所述闡明TGF-β1/Smads信號通路在RIHD心肌纖維化的形成過程中發揮重要作用，如果對其進行深入探究，可能會成為臨床干預RIHD心肌纖維化的有效作用靶點。同時TGF-β1下游信號轉導通路除了Smads信號通路，TGF-β1還可以作用其他非經典的信號通路，例如ERK、JNK、p38/MAPK、小分子GTP酶和CTGF等通路。這些通路具有多種生物學效應并相互影響，可能會對心臟產生其他毒性作用，各通路之間的關系尚需進一步研究。總之放射性心肌纖維化的形成因素包括多種因子和細胞信號通路，并且最終通路的生物學效應是心肌膠原的合成與降解的失衡，所以如果深入研究其下游共同通路，可能會為臨床干預RIHD心肌纖維化提供參考價值。