紅芪多糖對糖尿病小鼠腎臟組織α-SMA表達及腎小管間質損傷的影響研究

毛明鋒 雷文暉 周麗美 金烈

腎小管間質損傷是糖尿病腎病進展為終末期腎病的重要病理改變，然而目前臨床尚無有效的方法阻斷腎小管間質纖維化的發展。采取中醫中藥治療對糖尿病腎病患者而言意義重大。研究發現，中藥紅芪的提取物紅芪多糖（HPS）具有一定的腎臟保護作用。基于此，本研究以肌纖維母細胞的標志物α平滑肌肌動蛋白（α-SMA）為觀察指標，探討紅芪多糖對糖尿病小鼠腎臟組織α-SMA表達及對腎小管間質損傷的影響，現報道如下。

1 材料和方法

1.1 材料 11周齡雄性SPF級2型糖尿病db/db小鼠32只，體重（33±5）g；11周齡雄性 SPF級 db/m 小鼠（db/db小鼠的對照）8只，體重（20±3）g；兩種小鼠均購于上海斯萊克實驗動物有限責任公司。小鼠在室溫20～24℃的實驗動物房飼養籠中以嚙齒類動物常規飼料飼養，每籠6只。紅芪多糖購于陜西西安天瑞生物科技有限公司，純度80%。α-SMA抗體購于美國CST公司。SDSPAGE凝膠制備試劑盒購于北京索萊寶有限公司；SP檢測試劑盒購于杭州以恒生物科技有限公司；ECL化學發光試劑盒購于上海恪敏生物科技有限公司。石蠟切片機為德國徠卡顯微系統有限公司產品（型號：RM2235），光學顯微鏡為德國Leica公司產品（型號：DMD108），攤片機為湖北康強醫療器械有限公司產品（型號：TKD-TK）。

1.2 方法

1.2.1 動物分組和處理 db/db小鼠購入后適應性喂養10d，采用隨機數字表法分為糖尿病模型組、HPS高劑量組、HPS中劑量組、HPS低劑量組，每組各8只；另擇8只db/m小鼠作為正常對照組。HPS高劑量組、HPS中劑量組、HPS低劑量組小鼠分別給予HPS 400、200、100mg/（kg·d）灌胃干預，正常對照組、糖尿病模型組小鼠以等量的0.9%氯化鈉溶液灌胃。各組小鼠均連續灌胃8周，自由進食。8周后采用斷頭法處死小鼠，留取腎臟組織進行后續實驗。

1.2.2 腎臟組織病理檢查 腎臟組織以10%甲醛溶液固定，石蠟包埋、切片、HE染色，光學顯微鏡下觀察腎小球、腎小管間質細胞情況，評估腎小管間質損傷程度（按腎小管間質病變面積占腎皮質的百分比計算）。腎小管間質病變面積包括腎間質單個核細胞浸潤面積+萎縮的腎小管和腎間質纖維化的面積。腎小管間質損傷程度分為0～3級。0級：正常；1級：＜25%；2級：25%～50%；3級：＞50%。評估由2位病理科醫師進行，觀察10個視野以上，結果不一致時由2位醫師重復確認結果。

1.2.3 腎臟組織α-SMA表達強度檢測 將腎臟組織切片先用3%過氧化氫溶液清除內源性過氧化物酶，EDTA高壓熱修復抗原，依次按試劑盒說明書進行加入α-SMA抗體等操作步驟。按SP法行免疫組化染色，以PBS代替一抗建立陰性對照，光學顯微鏡下觀察腎臟組織α-SMA表達強度。α-SMA主要在腎小管間質表達，染色為淺黃色到深棕色為表達陽性細胞。α-SMA表達強度評估方法：陽性細胞數＜5%為陰性（-），6%～25%為弱陽性（+），26%～50%為陽性（++），51%～75%為中等陽性（+++），＞75%為強陽性（++++）。評估由2位病理科醫師進行，觀察10個視野以上，結果不一致時由2位醫師重復確認結果。

1.2.4 腎臟組織α-SMA表達水平檢測 采用Western blot法。取各小鼠100mg腎臟組織勻漿，超聲處理10～15s裂解細胞、提取DNA與總蛋白。取20μl樣品，在95～100°C環境下變性15 min，冷卻；微量離心機內離心5min，上樣到 SDS-PAGE 凝膠（10cm×10cm）上，后轉至PVDF膜，50g/L脫脂奶粉室溫封閉1h，加入兔抗小鼠α-SMA 單克隆抗體稀釋液（1∶100）孵育，4℃過夜；TBST洗膜10 min×3次，再加入辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔 IgG（1∶1 000），室溫孵育 2h；TBST 洗膜 10min×3次，ECL化學發光試劑放射自顯影。采用Image J軟件對結果進行半定量分析。

1.3 統計學處理 應用SPSS19.0統計軟件。計量資料以 表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗。等級資料多組間比較采用Kruskal-WallisH檢驗，組間兩兩比較采用Wilcoxon秩和檢驗；計數資料多組間比較采用χ2檢驗，組間兩兩比較采用χ2分割法。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 5組小鼠腎臟組織病理檢查結果 見圖1、表1。

由圖1可見，正常對照組小鼠腎臟組織腎小球、毛細血管結構正常，內皮細胞、系膜細胞無增生；糖尿病模型組小鼠腎臟組織可見腎小球肥大，系膜細胞增生，內皮細胞腫脹，腎小管細胞空泡變性，腎間質可見單個核細胞浸潤；與糖尿病模型比較，HPS高劑量組小鼠腎臟組織腎小管間質損傷程度減輕明顯，HPS中劑量組與HPS低劑量組小鼠腎臟組織腎小管間質損傷程度有減輕，但不明顯。由表1可見，5組小鼠腎臟組織腎小管間質損傷程度比較差異有統計學意義（P＜0.05），HPS高、中劑量組與糖尿病模型組比較均有統計學差異（均P＜0.05），HPS低劑量組與糖尿病模型組比較無統計學差異（P＞0.05），HPS高劑量組與HPS低、中劑量組比較均有統計學差異（均P＜0.05）。即糖尿病模型組小鼠腎臟組織腎小管間質損傷程度最重，除正常對照組外，HPS高劑量組小鼠腎臟組織腎小管間質損傷程度最輕。

圖1 光學顯微鏡下5組小鼠腎臟組織病理切片所見（a：正常對照組；b：糖尿病模型組；c：HPS高劑量組；d：HPS中劑量組；e：HPS低劑量組；HE 染色，×400）

表1 5組小鼠腎臟組織腎小管間質損傷程度比較

2.2 5組小鼠腎臟組織α-SMA表達強度比較 見圖2、表 2。

由圖2、表2可見，5組小鼠腎臟組織α-SMA表達陽性率比較差異有統計學意義（P＜0.05），HPS中、低劑量組與糖尿病模型組比較均無統計學差異（均P＞0.05），HPS高劑量組明顯低于糖尿病模型組（P＜0.05）。

2.35組小鼠腎臟組織α-SMA表達水平比較 見圖3-4。

由圖3-4可見，5組小鼠腎臟組織α-SMA表達水平比較差異均有統計學差異（P＜0.05），HPS高、中、低劑量組與糖尿病模型組均高于正常對照組（均P＜0.05），HPS低劑量組小鼠腎臟組織α-SMA表達水平＞HPS中劑量組＞HPS高劑量組（均P＜0.05）。

3 討論

圖2 光學顯微鏡下5組小鼠腎臟組織免疫組織化學染色所見（a：正常對照組；b：糖尿病模型組；c：HPS高劑量組；d：HPS中劑量組；e：HPS 低劑量組；SP 法，×200）

表2 5組小鼠腎臟組織α-SMA表達強度比較

圖3 5組小鼠腎臟組織α-SMA表達電泳圖

圖4 5組小鼠腎臟組織α-SMA表達水平比較（與糖尿病模型組比較，*P＜0.05）

糖尿病腎病已成為國民終末期腎病的主要病因之一[1]。因此，尋找能夠阻止糖尿病腎病發生、發展的有效方法一直是臨床研究的熱點。糖尿病腎病患者的腎臟組織可見腎小球肥大，基底膜增厚，系膜細胞增生，同時伴隨腎小管上皮細胞空泡變性，腎小管萎縮，腎間質炎癥細胞浸潤及纖維化。而腎間質纖維化的形成過程是腎小管細胞及腎間質細胞在多種因素的作用下向肌纖維母細胞轉化的過程[2]。本研究以α-SMA作為肌纖維母細胞的標志物，觀察糖尿病腎病小鼠的腎小管間質損傷程度。結果顯示，HPS干預治療后，HPS高劑量組小鼠腎臟組織腎小管間質損傷程度明顯減輕，且發現α-SMA表達下調。同時，本研究比較了不同HPS劑量干預治療對糖尿病小鼠的腎小管間質損傷的改善程度，結果顯示HPS高、中劑量組小鼠腎小管間質損傷程度明顯減輕。這說明，一定劑量的HPS對糖尿病小鼠腎臟組織具有一定的保護作用。但是在本研究HPS低劑量組中沒有發現這種作用，可能是由于本實驗干預時間較短、未達有效作用劑量等因素的影響。

紅芪是祖國傳統醫學中的著名中藥，為豆科植物多序巖黃芪的干燥根。紅芪的主要作用為固表止汗、補氣升陽、利水消腫[3]。HPS屬于雜多糖，是來源于紅芪的干燥根提取的多糖活性成分。已有研究表明，HPS具有多種生理學作用及延緩糖尿病腎病進展的作用，并且表現出腎臟保護作用。雷豐豐等[4]對Wistar大鼠腹腔分別注射 50、100、200、400mg/kg 不同濃度的 HPS，觀察其對大鼠體內超氧陰離子、羥自由基清除率的影響，結果表明HPS可明顯清除超氧陰離子、羥自由基，提高超氧化物歧化酶、谷胱甘肽過氧化物酶活性。金智生等[5]通過動物模型研究HPS對糖尿病大鼠血糖、血脂的影響，結果發現不同劑量HPS均能明顯改善糖尿病大鼠血糖水平，降低TC、TG、LDL-C水平，改善脂蛋白代謝。丁義蘭等[6]也指出HPS可降低2型糖尿病大鼠空腹血糖水平，提高脾臟指數和胸腺指數，減輕高糖對大鼠機體免疫器官的損傷，增強機體抗氧化防御能力。祁雪艷等[7]研究表明，HPS可能通過抑制腎小球系膜細胞上PKC蛋白的表達及增強TIMP-1 mRNA的表達，減緩糖尿病腎病的進展。本研究結果表明，HPS對糖尿病小鼠的腎小管間質損傷具有保護作用，并且具有抑制α-SMA的表達的作用。本研究結果與上述研究基本相符。

綜上所述，本研究結果表明，HPS能夠抑制2型糖尿病db/db小鼠腎臟組織α-SMA的表達，減輕腎小管間質損傷程度。