黃芪甲苷抑制粘著斑激酶磷酸化改善高糖環境下的足細胞黏附能力的研究

何東元 鄭志貴 陳宜方 陳建國

糖尿病腎病是終末期腎病患者的首要病因，而足細胞損傷是糖尿病腎病發生、發展的關鍵環節[1]。既往研究顯示，糖尿病患者早期就可出現足細胞黏附功能下降，足細胞脫落，導致腎小球基底膜裸露，加速糖尿病腎病進展[2]。粘著斑激酶（FAK）在細胞黏附和遷移中發揮重要作用，若缺乏FAK，細胞遷移能力會出現顯著降低，且FAK磷酸化可改變細胞的黏附能力[3]。有不少研究顯示，傳統中藥黃芪的重要活性成分黃芪甲苷（AS-IV）對足細胞具有保護作用[4-6]，但作用機制尚未完全闡明。基于此，本研究旨在觀察AS-IV對高糖環境下足細胞黏附能力的影響，并探討其作用機制，現報道如下。

1 材料和方法

1.1 材料 條件永生化小鼠足細胞（浙江醫院實驗室）；AS-IV 單體（TLC純度 98%）、D-葡萄糖和 γ-IFN（美國Sigma公司）；FBS、青霉素、鏈霉素和RPMI 1640培養液（美國Gibco公司）；抗FAK抗體、抗磷酸化FAK（p-FAK）抗體、抗GAPDH抗體、辣根過氧化物酶標記的二抗和ECL化學發光劑（美國Santa Cruz公司）；RAPA蛋白裂解緩沖液（中國上海聯碩生物科技有限公司）；BCA試劑盒（美國Pierce公司）；Transwell-Col PTFE過濾器（3μm孔，美國Corning公司）；細胞黏附熒光定量試劑盒（美國Calbiochem公司）；Bio-Rad 2000凝膠成像系統（美國Bio-Rad公司）；FlexStation 3熒光讀板儀（美國Molecular Devices公司）。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養和分組 條件永生化小鼠足細胞生長在RPMI 1640培養液（含10%FBS、100U/ml青霉素和100mg/L鏈霉素）中。在33℃、10U/ml γ-IFN條件下傳代，在37℃、無γ-IFN條件下誘導分化。分化后的足細胞用1%FBS培養液培養24h同步化后分為以下4組。正常對照組（Con組）：D-葡萄糖 5mmol/L；高糖組（HG組）：D-葡萄糖30mmol/L；高糖+低劑量AS-IV組（HG+LD 組）：D-葡萄糖 30mmol/L+AS-IV 50mg/L；高糖+高劑量AS-IV組（HG+HD組）：D-葡萄糖30mmol/L+ASIV 100mg/L。

1.2.2 足細胞黏附能力測定 使用細胞黏附熒光定量試劑盒檢測足細胞黏附能力。分化的足細胞種植在分別鋪有基底膜復合物（BMC）、小牛血清白蛋白（陰性對照）和多聚賴氨酸（陽性對照）的96孔培養板中，按上述分組進行干預。各組于干預3、6、12和24h后分別隨機選取24孔棄去培養液，每孔200μl PBS沖洗2次除去未黏附的細胞，每孔加入100μl熒光Calcein-A M工作液，37℃、5%CO2細胞培養箱中孵育1h，熒光讀板儀（FlexStation 384）上檢測每孔相對熒光強度（RFU），激發波長485 nm、發射波長520 nm。RFU值越大，說明黏附的細胞數量越多，細胞黏附能力越強。

1.2.3 白蛋白流量率檢測法測定足細胞單層屏障功能（單層滲漏白蛋白濃度） 5×105個分化的足細胞接種于Ⅰ型膠原包被Transwell上室（3μm孔），不同條件下培養48h。丟棄培養液，用含1mmol/L CaCl2和1mmol/L MgCl2的PBS洗2次。然后，上室填充0.15ml的RPMI 1640，底腔填充1ml含40mg/ml小牛血清白蛋白的RPMI 1640培養液37℃孵育6h。BCA試劑盒檢測上室培養液白蛋白濃度。

1.2.4 Western blot法檢測FAK與p-FAK表達 各組細胞干預24、48h后，蛋白裂解液裂解各組細胞，10%SDS-PAGE凝膠電泳分離，2%小牛血清白蛋白的TBST室溫封閉60min，加入抗FAK、抗p-FAK和抗GAPDH抗體4℃孵育24h，加入辣根過氧化物酶標記的二抗室溫孵育60min，ECL發光劑在X線片上曝光顯影。Bio-Rad 2000凝膠成像系統掃描光密度。實驗重復3次，得出目的蛋白與GAPDH光密度比值作為目的蛋白表達水平。

1.3 觀察指標 觀察并比較（1）4組足細胞黏附能力；（2）4組足細胞單層屏障功能；（3）4組足細胞FAK與p-FAK表達情況。

1.4 統計學處理 應用SigmaStat 12.0統計軟件；計量資料以 表示，多組比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗；P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 4組足細胞黏附能力比較 見圖1。

圖1 4組足細胞黏附能力比較

由圖1可見，干預12h后，4組足細胞黏附能力比較差異有統計學意義（P＜0.05），干預 3、6、12、24h 后，Con、HG、HG+HD組足細胞黏附能力比較差異亦均有統計學意義（均P＜0.05）。即高糖環境會降低足細胞的黏附能力，而AS-IV可明顯增強高糖環境下足細胞的黏附能力，且該作用具有時間和劑量依賴性。

2.2 4組足細胞單層屏障功能比較 見圖2。

圖2 4組足細胞單層屏障功能比較

由圖2可見，4組足細胞單層屏障功能比較差異有統計學意義（P＜0.05）。即高糖環境會降低足細胞單層屏障功能，而AS-IV可劑量依賴性地增強高糖環境下足細胞單層屏障功能。

2.3 4組足細胞FAK與p-FAK表達情況比較 見圖3。

圖3 4組足細胞FAK與p-FAK表達情況比較

由圖3可見，干預24、48h后，4組足細胞FAK表達情況比較均無統計學差異（均P＞0.05），p-FAK表達情況比較均有統計學差異（均P＜0.05）。即高糖環境對足細胞FAK表達無明顯影響，但會明顯增加FAK磷酸化；AS-IV可明顯抑制高糖環境下足細胞FAK蛋白磷酸化，且該作用具有時間和劑量依賴性。

3 討論

祖國傳統醫學認為黃芪具有補氣升陽、益衛固表、利水消腫等功效。黃芪用于治療糖尿病和腎臟疾病已有上千年的歷史[4]。AS-IV是黃芪主要活性成分，具有調節免疫、抗炎癥因子、抗間質纖維化、抗凋亡和抗氧化應激等多方面藥理作用。AS-IV被2005版《中國藥典》納作評估黃芪藥材質量的指標。既往研究顯示，AS-IV可通過抑制PERK-ATF4-CHOP信號通路抑制高糖環境下足細胞凋亡[5]，抑制NF-κB改善糖尿病大鼠足細胞足突融合，降低蛋白尿[6]，但AS-IV對足細胞的保護作用機制尚未完全闡明。足細胞是腎小球濾過屏障的重要組成部分，足細胞數量減少和/或功能障礙與蛋白尿的發生、發展密切相關[7]。高糖環境下足細胞黏附能力減弱是足細胞從腎小球基底膜脫落的重要原因，也是早期糖尿病腎病進展的重要原因[1]。足細胞是終末分化細胞，幾乎沒有增殖能力[7]。足細胞脫落或壞死將導致足細胞數量不可逆性減少，基底膜裸露，腎小球壁層上皮細胞和裸露的基底膜粘連，最終導致腎小球硬化和腎臟功能衰竭[8]。研究顯示，1型糖尿病和2型糖尿病早期均有足細胞脫落和數量減少現象[9]。減少足細胞脫落可能成為未來糖尿病腎病治療的靶點。本研究采用細胞黏附熒光定量試劑盒檢測足細胞和BMC之間的黏附能力，采用白蛋白流量率檢測法檢測足細胞單層屏障功能。結果顯示，高糖環境下足細胞與BMC之間的黏附能力明顯下降，足細胞單層屏障功能明顯下降，而AS-IV干預可增強高糖環境下足細胞黏附能力，增強足細胞單層屏障功能，其作用具有時間和劑量依賴性。

FAK是一種非受體絡氨酸激酶，在細胞黏附中起重要作用。目前認為FAK和β整合素直接相連，是整合素信號傳導的中樞介質，也是其他細胞表面受體信號傳遞的重要組成部分[10]。FAK磷酸化是整合素、生長因子和細胞外基質蛋白啟動的信號通路中的早期事件，FAK調節細胞遷移在許多類型細胞中已被證實。表皮傷口愈合過程中遷移的角質形成細胞FAK表達或激活增加，在體外培養的內皮細胞遷移過程中也觀察到相同現象[11-12]。FAK在腎臟發育和細胞分化中起重要作用。FAK基因敲除的小鼠出現嚴重的中胚層缺陷，在胚胎早期死亡[13]。FAK沉默的成纖維細胞遷移能力嚴重缺陷[14]。抑制FAK磷酸化可導致成纖維細胞和內皮細胞遷移能力下降，過度表達FAK可導致多種細胞遷移能力增加[15]。既往研究顯示，足細胞表達FAK，足細胞損傷后FAK磷酸化增加。FAK磷酸化后可以激活多個下游信號通路，其中FAK/p38 MAPK通路是重要的一條。p38 MAPK屬于絲氨酸/蘇氨酸激酶家族，在炎癥、氧化應激、衰老、自噬以及細胞凋亡中均有重要作用[16]。FAK/p38 MAPK通路參與阿霉素[17]和轉化生長因子β1誘導的足細胞損傷[18]。足細胞特異性敲除FAK基因或藥物抑制FAK/p38 MAPK信號通路可緩解蛋白尿和足細胞足突融合[17，19]。本研究結果與既往研究結果相符，高糖環境對足細胞FAK表達無明顯影響，但會明顯增加FAK磷酸化；AS-IV可明顯抑制高糖環境下足細胞FAK蛋白磷酸化，且該作用具有時間和劑量依賴性。

綜上所述，AS-IV可能通過抑制FAK磷酸化改善高糖環境下足細胞的黏附能力。本研究結果或將為糖尿病腎病的早期治療提供理論參考。