長鏈非編碼RNA AC003973.4對乳腺癌細胞增殖、遷移和侵襲的影響研究

郭文利 黃建棋 陸建菊 陸凱

乳腺癌是全球女性最常見的惡性腫瘤之一，也是我國女性第二位常見的惡性腫瘤，且近年來我國乳腺癌發病率呈迅速上升趨勢[1]。一大部分乳腺癌患者被確診時已處于癌癥進展期，遠處轉移是乳腺癌患者死亡的主要原因，因此預防或減緩乳腺癌的進展和轉移對于改善患者的預后有重要意義[2]。長鏈非編碼RNA（lncRNA）在腫瘤發生、發展中的作用越來越受關注，lncRNA在多種腫瘤組織中表達失調，通過調控癌基因或抑癌基因的表達影響腫瘤的進展和轉移[3-6]。AC003973.4是一個編碼1 394個核苷酸的lncRNA。本研究通過檢測AC003973.4在乳腺癌組織和細胞株中的表達情況，分析AC003973.4對乳腺癌細胞增殖、遷移和侵襲的影響，探討AC003973.4與乳腺癌進展和轉移的關系，現報道如下。

1 材料和方法

1.1 實驗材料 RPMI 1640培養基、DMEM高糖培養基和FBS購自美國Gibco公司；人乳腺癌細胞株BT-549、MDA-MB-231、MCF-7、T47D和正常乳腺上皮細胞株MCF-10A均購自中國科學院細胞培養中心；過表達AC003973.4的質粒（pcDNA3.1-AC003973.4）和陰性對照質粒購自上海吉瑪生物技術公司；Lipofectamine 3000脂質體轉染試劑購自美國Invitrogen公司；實時熒光定量PCR（qRT-PCR）試劑盒和引物購自上海生工生物工程公司；MTS試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司；Transwell小室購自美國Corning公司；Matrige基質膠購自美國 BD 公司；抗 PTEN、CDK4、Cyclin D1、Zeb-1、N-cadherin及β-actin抗體均購自美國Santa Cruz公司。

1.2 實驗標本 本研究經嘉興市第一醫院醫學倫理委員會批準，患者均簽署知情同意書。20例乳腺癌組織和配對的癌旁組織標本來源于2015年3月至2017年9月本院乳腺外科收治的行手術切除治療的乳腺癌患者，癌旁組織取距腫瘤邊緣＞1cm且＜3cm的組織。組織標本于手術切除后均迅速冷凍保存，且患者術前均未接受放化療，術后病理學檢查確診乳腺癌。

1.3 實驗方法

1.3.1 細胞培養和轉染 BT-549和MCF-7細胞培養于含10%FBS的RPMI 1640培養基，MDA-MB-231、T47D和MCF-10A細胞培養于含10%FBS的DMEM高糖培養基，于37℃、5%CO2培養箱中培養。選取對數生長期的MCF-7細胞進行轉染，參照脂質體Lipofectamine 3000轉染說明書進行操作。將MCF-7細胞以每孔4×105個接種于6孔板，待匯合度為60%時，分別將pcDNA3.1-AC003973.4質粒和陰性對照質粒轉染至MCF-7細胞，分別為實驗組和對照組，繼續培養12h后更換新鮮培養基。

1.3.2 qRT-PCR 檢測 AC003973.4、miR-224-5p和PTEN mRNA表達水平 使用Trizol試劑對組織和細胞進行RNA抽提。分光光度儀檢測RNA濃度和純度，將RNA逆轉錄為cDNA后進行qRT-PCR反應，分別以GAPDH和U6為內參，檢測AC003973.4、miR-224-5p和PTEN mRNA的相對表達水平。qRT-PCR反應體系為：cDNA 2μl、混合液 10μl、上下游引物各 2μl、雙蒸水2μl。反應條件為 94℃預變性 10min、59℃ 30s、72℃ 30s，共35個循環。AC003973.4的上游序列為 5′-TCTTTCCTCAGGAGGTATTGTGA-3′，下游序列為 5′-CACATCACCAAGGTTCTGGTT-3′；PTEN 的上游序列為 5′-AGGGACGAACTGGTGTAATGA-3′，下游序列為 5′-CTGGTCCTTACTTCCCCATAGAA-3′；GAPDH 的上游序列為 5′-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3′，下游序列為5′-GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-3′；U6 的上游序列為 5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，下游序列為 5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′；miR-224-5p 的上游序列為 5′-GGGTCAAGTCACTAGTGGTTCC-3′，下游序列為 5′-CAGTGCGTGTCGTGGAGT-3′。

1.3.3 MTS法檢測細胞增殖能力 取轉染后狀態良好的實驗組和對照組MCF-7細胞，胰酶消化收集細胞，培養基調整細胞密度為 1×104個/ml，以 2×103個/孔重新接種于96孔板。使用MTS試劑盒檢測細胞增殖能力，避光條件下，每孔加入濃度為15%的MTS試劑10μl，培養箱內繼續培養2h，酶標儀檢測各孔在450 nm波長處的光密度（D）值。以接種后12h為MTS實驗的第0d，分別檢測第0、1、2、3、4 d的細胞增殖能力。實驗重復4次。

1.3.4 Transwell遷移實驗檢測細胞遷移能力 取轉染后狀態良好的實驗組和對照組MCF-7細胞，胰酶消化收集細胞，使用無血清培養基調整細胞密度為1.5×105個/ml，將細胞懸液以 200μl/孔加入 Transwell上室，下室加入600μl含血清的培養基，培養箱中繼續培養。24h后，取出上室，用95%的甲醇溶液固定，用0.1%

1.5 統計學處理 應用SPSS 21.0統計軟件；計量資料以表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗；P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 乳腺癌組織與癌旁組織、乳腺癌細胞株與正常乳腺上皮細胞株AC003973.4表達水平比較 見圖1、2。

由圖1可見，AC003973.4在乳腺癌組織中表達水平明顯低于癌旁組織[（1.48±0.12）vs（5.53±0.24），P＜0.01]。由圖2可見，AC003973.4在乳腺癌細胞株BT-549（0.41 ± 0.08）、MDA-MB-231（0.73 ± 0.04）、MCF-7（0.17± 0.04）和T47D（0.49± 0.04）中呈低表達，而在人正常乳腺上皮細胞株MCF-10A（1.00±0.07）中呈高表的結晶紫溶液染色，在倒置光學顯微鏡下觀察，取4個視野（×100）計數基底膜細胞數，計算平均值。實驗重復4次。

1.3.5 Transwell侵襲實驗檢測細胞侵襲能力 在Transwell上室鋪Matrige基質膠40μl/孔，培養箱內靜置5h風干后，其余操作同Transwell遷移實驗。

1.3.6 生物信息學法預測AC003973.4互補結合的miRNA及下游靶基因 采用LncBase Predicted v.2軟件分析AC003973.4可互補結合的miRNA，采用TargetScan Release 7.2軟件預測miRNA的下游靶基因。

1.3.7 Western blot法檢測細胞PTEN蛋白、細胞增殖與遷移相關蛋白表達水平 取轉染后狀態良好的實驗組和對照組MCF-7細胞，PBS溶液洗滌后，加入含蛋白酶抑制劑的細胞裂解液提取總蛋白，測定蛋白濃度。每組取45μg蛋白進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，濕法將蛋白轉至硝酸纖維素膜，5%脫脂牛奶封閉。TBST溶液洗膜后加入Ⅰ抗冰箱內孵育過夜，Ⅰ抗稀釋比例分別為PTEN（1∶1 000）、CDK4（1∶1 500）、Cyclin D1（1∶500）、Zeb-1（1∶500）、N-cadherin（1∶500）及 β-actin（1∶2 000）。TBST溶液洗膜后，加入Ⅱ抗室溫孵育。TBST溶液洗膜后，加入顯影液顯影。β-actin為內參蛋白，實驗重復4次。

1.4 觀察指標 （1）比較乳腺癌組織與癌旁組織、乳腺癌細胞株與正常乳腺上皮細胞株AC003973.4表達水平；（2）比較實驗組與對照組MCF-7細胞AC003973.4表達水平；（3）比較實驗組與對照組MCF-7細胞增殖能力、遷移、侵襲能力；（4）觀察AC003973.4互補結合的miRNA及下游基因預測結果；（5）比較實驗組與對照組MCF-7細胞miR-224-5p、PTEN mRNA表達水平與PTEN、CDK4、Cyclin D1、Zeb-1、N-cadherin 蛋白表達水平。達，差異有統計學意義（均P＜0.05），在MCF-7細胞中表達水平最低（P＜0.01）。

圖1 乳腺癌組織與癌旁組織AC003973.4表達水平比較（**P＜0.01）

圖2 乳腺癌細胞株和正常乳腺上皮細胞株AC003973.4表達水平比較（與 MCF-10A 細胞株比較，*P＜0.05，**P＜0.01）

2.2 實驗組與對照組MCF-7細胞AC003973.4表達水平比較 見圖3。

圖3 實驗組與對照組MCF-7細胞AC003973.4表達水平比較（**P＜0.01）

由圖3可見，實驗組MCF-7細胞AC003973.4表達水平明顯高于對照組[（7.50±0.75）vs（1.02±0.10），P＜0.01]，即轉染pcDNA3.1-AC003973.4質粒的MCF-7細胞AC003973.4的表達水平明顯上調。

2.3 實驗組與對照組MCF-7細胞增殖能力比較 見圖4。

圖4 實驗組與對照組MCF-7細胞增殖能力比較（*P＜0.05，**P＜0.01）

由圖 4 可見，第 1、2、3、4d，實驗組 MCF-7 細胞的D 值分別為 0.42±0.03、0.63±0.03、1.02±0.07、1.21±0.06，對照組MCF-7細胞的D值分別為 0.59±0.05、0.90±0.07、1.47±0.06、1.58±0.07，實驗組 MCF-7 細胞的 D 值均低于對照組（均P＜0.05），即上調AC003973.4的表達水平可減弱MCF-7細胞的增殖能力。

2.4 實驗組與對照組MCF-7細胞遷移能力比較 見圖5。

由圖5可見，實驗組MCF-7細胞的穿膜細胞數明顯低于對照組[（126.70±15.47）個/視野vs（229.30±13.59）個/視野，P＜0.01]，即上調 AC003973.4 的表達水平可減弱MCF-7細胞的遷移能力。

圖5 實驗組與對照組MCF-7細胞遷移能力比較（a：光學顯微鏡下所見，結晶紫染色，×100；b：穿膜細胞數比較，**P＜0.01）

2.5 實驗組與對照組MCF-7細胞侵襲能力比較 見 圖6。

圖6 實驗組與對照組MCF-7細胞侵襲能力比較（a：光學顯微鏡下所見，結晶紫染色，×100；b：穿膜細胞數比較，*P＜0.05）

由圖6可見，實驗組MCF-7細胞的穿膜細胞數明顯低于對照組[（37.33±8.32）個/視野vs（70.56±4.71）個/視野，P＜0.05]，即上調AC003973.4的表達水平可減弱MCF-7細胞的侵襲能力。2.6 AC003973.4互補結合的miRNA及下游基因預測結果 用LncBase Predicted v.2軟件預測的結果表明，AC003973.4可互補結合miR-224-5p。TargetScan Release 7.2軟件預測結果表明，miR-224-5p可互補結合的下游靶基因為 PTEN，mirSVR score 為-0.7800，Phast－Cons score為 0.5133，見圖 7。

圖7 AC003973.4互補結合的miRNA及下游基因預測結果

2.7 實驗組與對照組MCF-7細胞miR-224-5p、PTEN mRNA表達水平比較 實驗組MCF-7細胞miR-224-5p表達水平明顯低于對照組[（0.30±0.07）vs（1.00±0.06），P＜0.01]，實驗組MCF-7細胞PTEN mRNA表達水平明顯高于對照組[（5.51±0.44）vs（1.00±0.06），P＜0.01]，即上調AC003973.4表達水平可抑制MCF-7細胞miR-224-5p的表達，促進PTEN mRNA的表達。

2.8 實驗組與對照組MCF-7細胞PTEN、CDK4、Cyclin D1、Zeb-1、N-cadherin蛋白表達水平比較 見圖8。

圖8 實驗組與對照組MCF-7細胞PTEN、CDK4、Cyclin D1、Zeb-1、N-cadherin蛋白表達水平比較（a：各蛋白電泳圖；b：兩組細胞各蛋白表達水平比較，**P＜0.01）

由圖8可見，實驗組MCF-7細胞PTEN蛋白表達水平高于對照組（P＜0.01），細胞增殖相關蛋白CDK4、Cyclin D1與細胞遷移相關蛋白Zeb-1、N-cadherin表達水平均低于對照組（均P＜0.01），即實驗組MCF-7細胞的增殖、遷移和侵襲能力均減弱。

3 討論

lncRNA是一類長度超過200個核苷酸、自身不編碼蛋白的RNA，以往認為lncRNA沒有實際作用，然而近來研究發現lncRNA在基因轉錄過程中發揮重要作用，可通過表觀遺傳學調控細胞功能[7-8]，在多種腫瘤組織中均發現表達異常的lncRNA，lncRNA可能廣泛參與腫瘤的發生發展[9]。眾多lncRNA如SNHG15、SNHG16、MEG3被發現在乳腺癌組織中表達上調或下調，在乳腺癌中發揮癌基因或抑癌基因作用[10-12]。AC003973.4是一種新發現的尚不清楚作用的lncRNA。

本研究結果表明，在乳腺癌組織和乳腺癌細胞株中AC003973.4的表達水平分別明顯低于癌旁組織和正常乳腺上皮細胞。上調乳腺癌MCF-7細胞中AC003973.4的表達水平后，細胞增殖、遷移和侵襲能力均明顯被抑制。以上結果提示，AC003973.4的異常表達可能參與調控乳腺癌的進展和轉移。目前研究發現，lncRNA發揮作用的重要機制之一是通過吸附可互補結合的miRNA，減少下游miRNA的表達，發揮“海綿”作用[13]。miRNA是一類長度約為19～25個核苷酸的非編碼RNA，可互補結合下游靶基因mRNA，干擾下游基因的表達[14-15]。lncRNA可通過減少miRNA的表達，干擾miRNA對下游靶基因的抑制作用。本研究應用LncBase Predicted v.2軟件預測發現，AC003973.4可互補結合miR-224-5p。本研究上調MCF-7細胞AC003973.4表達水平后，miR-224-5p的表達降低，表明AC003973.4可能具有吸附miR-224-5p的作用。miR-224-5p在胰腺癌、非小細胞肺癌、胃癌、宮頸癌中呈高表達水平，具有促進腫瘤細胞生長和轉移的作用，表現為癌基因[14，16-17]。本研究利用TargetScan Release 7.2軟件預測發現，miR-224-5p可互補結合PTEN。PTEN基因是目前發現的第一個具有脂質磷酸酶活性和蛋白磷酸酶活性的抑癌基因，其表達下調可干擾腫瘤細胞的細胞骨架重構[18]。PTEN是近年來抑癌基因研究的熱點之一，在包括乳腺癌在內的人類大多數惡性腫瘤的發生、發展中發揮重要的調控作用[19]。上調PTEN基因的表達后，乳腺癌等腫瘤進展和轉移明顯減緩[20]。本研究結果表明，MCF-7細胞miR-224-5p表達下調后，PTEN基因的表達上調，PTEN蛋白表達上調的同時，細胞增殖相關蛋白CDK4和Cyclin D1的表達下調，細胞轉移相關蛋白Zeb-1和N-cadherin的蛋白表達下調，表明MCF-7細胞的增殖、遷移和侵襲能力均下降。

綜上所述，AC003973.4在乳腺癌組織和乳腺癌細胞中的表達下調，上調AC003973.4的表達可減弱MCF-7細胞的增殖、遷移和侵襲能力，其作用機制可能為AC003973.4吸附并降低miR-224-5p的表達，從而干擾miR-224-5p對PTEN抑癌基因的抑制作用。AC003973.4可能為乳腺癌進展和轉移潛在的預測分子和治療靶點。