不同消毒劑及激素對黃果西番蓮莖段組織培養的影響①

黃東梅 吳 斌 馬伏寧 陳 弟 宋 順

(中國熱帶農業科學院海口實驗站/海南省香蕉遺傳改良重點實驗室 海南海口571101)

西番蓮（Passiflora edulisSims）又名百香果、熱情果（passion fruit），為熱帶、亞熱帶多年生半木質藤本常綠果樹，原產澳大利亞和南美洲，目前在全球熱區有廣泛種植。中國西番蓮主栽品種有紫果種（P. edulis）、黃果種（P.edulisf.flavicarpa）、雜交種三大類。西番蓮果實香味多樣濃郁，且富含多種維生素、氨基酸及微量元素，風味獨特，營養豐富，深受消費者喜愛，具有較高的經濟效益，適宜推廣種植［1-2]。目前影響西番蓮種植推廣的一個重要因素是健康無毒種苗的獲得。已發表的影響百香果的病毒記錄有近20 種，病毒潛伏期長，擴散迅速，嚴重時可造成全株死亡甚至蔓延至整個果園，造成較大的經濟損失，因此，亟需開發完善的脫毒技術［3-4]。植物的組織培養具有繁殖系數大、周期短、去除病毒迅速等優點，可作為脫毒技術的一個重要手段［5]。關于西番蓮組培技術目前有少量文獻報道，外植體一般選擇葉片［6-7]、莖段［8-9]、幼嫩卷須［10]和下胚軸［11]等，其中以莖段為材料報道最多。Prithviraj 等［7]以葉片為外植體，在MS＋6-BA 3.0 mg/L 培養基上分化率98%，增殖效率可達到100株/每外植體；張琴等［11]研究發現，以紫果西番蓮下胚軸的分化效率較子葉高，下胚軸在MS＋6-BA 3.0 mg/L＋NAA 0.2 mg/L 培養基上不定芽分化率最高；陳發興［12]以紫果西番蓮的葉盤、葉柄、莖段、卷須為外植體直接誘導不定芽結果表明，葉盤和卷須誘導不定芽比較困難，而葉柄相對容易，莖段在ZEA 達到2～3 mg/L 時，外植體萌芽率高達100%；Pipino 等［10]以西番蓮雜交品種“Guglielmo Betto” 幼嫩腋生卷須為外植體在MS基本培養基添加49.20 μmol/L 2-IP和2.68 μmol/L NAA 或4.43 μmol/L 6-BA 和11.41 μmol/L IAA 可直接分化出不定芽，其中前者芽分化率可達90%。西番蓮的組培技術還難以推廣應用于種苗繁育，主要受限于基因型差異大、外植體的消毒難、增殖系數低、生根效率低等技術瓶頸。本研究對象為南美引進試種成功的黃果西番蓮，該品種果皮黃色，果肉橙紅色，果型較現有主推品種大，果肉量多，酸甜比值優異，具有較高的經濟價值。本試驗擬對消毒劑、激素等影響黃果西番蓮莖段組培快繁的因素進行研究，以保持母本的優良性狀，為后期種質保存及健康無毒種苗生產、種植和推廣提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗以從南美引進的在澄邁縣白蓮基地適應性種植的黃果西番蓮（Passiflora edulisf.flavicarpa）為材料，選取一年生、生長健康的莖段。

1.2 方法

1.2.1 外植體的預處理及消毒

選取田間采集的莖段，流水沖洗表面，浸泡于0.2%高錳酸鉀溶液中進行初步消毒處理，后扦插于水培培養基中，定期更換培養基［13]，培養一段時間后，選取新生的幼嫩莖段作為外植體。外植體的消毒首先用70%酒精消毒30 s，繼而選用0.1% HgCl2或2% NaClO 溶液消毒，處理時間包括10、15、20 min，后用無菌水沖洗3～5 次，用無菌濾紙將外植體表面的水吸干，接種至芽誘導培養基上，以MS＋6-BA 1.0 mg/L＋IAA 1.0 mg/L 為基本芽誘導培養基，試驗采用完全隨機試驗設計，每個處理組合10 個外植體，重復3 次。觀察外植體污染及生長情況并記錄，根據結果篩選合適的消毒藥劑和消毒時間。

污染率＝（污染外植體總數/外植體總數）×100%

未污染存活率＝（未污染且外植體接種10 d后仍保持綠色外植體數/未污染外植體總數）×100%。

1.2.2 不同激素濃度對西番蓮莖段芽誘導的影響

激素選用細胞分裂素6-BA（1.0、2.0、3.0 mg/L） 和 生 長 素IAA （1.0、2.0 mg/L） 或NAA（0.1、0.3 mg/L）接種表面消毒處理好的外植體，完全隨機組合試驗設計，共12 個處理組合，每個處理組合9 個外植體，重復3 次。根據統計結果篩選最優化的芽誘導培養基。

1.2.3 不同激素濃度對生根誘導的影響

再生芽經過增殖壯苗長至2～3 cm 后，將芽切下，轉至添加IBA（0、0.5、1.0、1.5、2.0 mg/L）的1/2 MS 培養基中進行生根誘導，每個處理接種3瓶，每瓶接1 株，重復3 次，觀察并統計生根情況，篩選最佳生根培養基。

1.2.4 數據分析與處理

試驗數據采用Excel 2016 進行統計分析，不同處理之間采用LSD 法進行差異顯著性檢驗（p＜0.05）。

2 結果與分析

2.1 不同消毒處理污染情況

隨著消毒時間的增加，污染率呈下降的趨勢，未污染存活率呈平穩后下降的趨勢，表明消毒處理時間越長消毒越徹底但同時外植體越容易受消毒液毒害，0.1% HgCl2的消毒效果好于2% NaClO（表1）。選擇污染率低且外植體存活率高的組合為最優化的消毒處理方法，即0.1% HgCl2處理15 min。

表1 不同消毒處理對西番蓮莖段芽誘導的影響

2.2 不同激素對芽誘導的影響

外植體在芽誘導培養基上受細胞分裂素和生長素的綜合影響，培養一周左右逐漸膨大，隨著培養時間的推進，有在莖段節點冒出數個芽點，也有僅莖段膨大在切口處長出新生細胞堆積形成瘤狀愈傷組織的，不同培養及配方的出芽率和形態均有差別。外植體在6-BA＋IAA組合的培養基芽誘導率較MS＋6-BA＋NAA高一些（表2）。外植體在6-BA＋IAA 組合培養基里誘導的叢生芽呈現綠色，芽點較多，而6-BA＋NAA組合培養基里的外植體長出的叢生芽芽點較少，在莖段上長出一點一點白色蓬松的愈傷組織。故6-BA＋IAA更適合用于黃果西番蓮莖段再生芽的誘導培養，以MS＋6-BA 2.0 mg/L＋IAA 1.0 mg/L中芽誘導率最高。

2.3 不同激素濃度對生根的影響

不定芽接種在生根培養基后，基部逐漸膨大并長出根原基，隨后根毛逐漸伸長，形成根系良好的完整植株。黃果西番蓮的不定芽在添加或無添加IBA 的培養基上均能生根，但在添加IBA 的培養基上生根效果較好，不同IBA濃度對生根誘導影響結果（表3），以MS＋IBA 0.5～1.0 mg/L培養基誘導生根最好。黃果西番蓮莖段組培過程（圖1）。

表2 不同激素濃度對西番蓮莖段再生芽誘導的影響

表3 不同激素濃度對西番蓮再生芽生根誘導的影響

3 討論與結論

3.1 討論

植物組織培養中，對田間取材的植物材料進行預處理很有必要，田間復雜的環境導致病蟲害較多，且西番蓮的匍匐莖是中空的，難以消毒干凈。外植體消毒是組織培養繁殖方式最重要的環節之一，通常消毒劑對植物材料都具有毒害作用，且對環境的污染也比較嚴重［14]，因此選擇適當的消毒劑種類和處理時間非常關鍵。李紅艷［15]在不同滅菌劑對紫果西番蓮莖段無菌芽誘導的影響進行研究，結果顯示，雙因子HgCl210 min＋NaClO 10 min是最佳的滅菌處理組合。本試驗選取田間采集的一年生黃果西番蓮健康莖段進行初步消毒、水培扦插后新生的幼嫩腋芽及莖段作為外植體，比直接從田間采集的幼嫩腋芽和莖段更少接觸病蟲害，在相同消毒處理下有助于降低污染率。此外，在提高消毒時間追求低污染率的同時還要兼顧未污染外植體的存活率方有實際意義。在本研究中對兩者數據均作了統計，結果顯示0.1%HgCl2消毒15 min，污染率為26.7%，未污染存活率為95.2%，為優化的消毒處理方法。

圖1 黃果西番蓮莖段組織培養

在前人對西番蓮莖段組培的研究中，Costa等［9]研究發現，低濃度的細胞分裂素適合黃果西番蓮莖段外植體芽的增殖和葉的發育，細胞分裂素和生長素不利于根系的分化和生長；楊冬業等［8]以西番蓮莖段為外植體，在MS＋6-BA2.0mg/L上叢生芽誘導率達100%；史沉魚等［16]認為，最佳叢生芽誘導培養基為MS＋6-BA 2.0 mg/L＋NAA 0.2 mg/L＋土豆泥200 mg/L；孫琪等［17]以西番蓮當年生幼嫩莖段為材料在MS＋1.0 mg/L 6-BA＋0.05 mg/L IAA 中芽誘導率最高。本試驗選用6-BA 和IAA、NAA 激素組合進行對比試驗，結果為黃果西番蓮幼嫩腋芽和莖段在MS＋6-BA＋IAA 組合的培養基上芽誘導效果較好，與孫琪等［17]研究結果相似。

生根培養方面，外源的生長素可以有效的刺激細胞的分裂和根原基的形成，促進生根誘導和伸長，組培中最常用的生根劑為IBA 和NAA。史沉魚等［16]研究結果表明，紫果西番蓮再生芽的最佳生根誘導培養基為MS+IBA 2.0 mg/L＋NAA 0.2 mg/L＋活性炭2.0 g/L；Prithviraj 等［7]發現，黃果西番蓮再生芽在1/2 MS＋IBA 0.5～1.0 mg/L 生根效果好，生根率達96%以上。本研究結果與Prithvi‐raj 等［7]研究結果一致。

3.2 結論

本試驗以南美引進黃果西番蓮一年生健康莖段經過預處理后水培扦插長出的腋芽和幼嫩莖段為外植體，對外植體的消毒試劑及時間、芽誘導培養基激素及濃度、生根培養基的激素濃度進行優化篩選。結果表明：經過預處理水培扦插后的外植體經過0.1%升汞處理15 min 后污染率最低且未污染成活率最高；外植體在MS＋6-BA 2.0 mg/L＋IAA 1.0 mg/L 上芽誘導率最高，為96.3%；不定芽在1/2 MS＋IBA 0.5～1.0 mg/L 培養基上生根效果最好，生根誘導率最高可達100%。

本研究獲得了一套適宜南美引進黃果西番蓮的組培快繁方法，可應用于母本資源保存和種苗繁育。