胚胎植入前基因檢測技術的研究進展和思考▲

楊 華 吳 卓 李春苑 陳自洪 鄒 彥 鄧志華 韋永全 曾建偉 廖維芳 譚慶英 梁新紅 黃柳靜 丘 映 許常龍

(南寧市第二人民醫院生殖醫學中心，廣西南寧市 530031，電子郵箱：85308539@qq.com)

【提要】 胚胎植入前基因篩查和植入前遺傳學診斷能夠幫助檢測胚胎的整倍性，并檢測其是否攜帶遺傳病致病基因，從而篩選出更為健康的胚胎以提高妊娠率。將早期的活檢技術結合近些年研發出的新一代分子生物學檢測技術，使得胚胎植入前基因檢測技術具有更高的精確度以及更優的時效性。本文針對胚胎植入前基因檢測技術的研究現狀進行綜述，并從社會和人文角度對該技術的應用進行展望和思考。

在我國，由出生缺陷問題所導致的圍產兒和嬰兒死亡的現象較為常見，即便患兒能夠存活，由缺陷帶來的殘疾和其他問題也嚴重影響患兒的生活質量，給家庭成員帶來巨大的心理負擔和精神壓力。單基因遺傳病是造成新生兒出生缺陷的主要疾病之一，指由基因組DNA上一個或一對等位基因突變所導致且符合孟德爾遺傳規律的疾病，包括顯性遺傳、隱性遺傳及X-連鎖遺傳等多種遺傳類型。雖然單基因遺傳病的單個病種發病率較低，但由于其病種繁多，所以在出生活嬰中的總體發病率和人群中的總體患病率很高[1]。現代醫學還不能改變已出生者的基因，絕大多數遺傳病無法治愈，而且患者的致病基因會傳遞給子孫后代，解決這一問題的根本途徑是進行出生前或胚胎移植前診斷，從而避免此類患兒出生。

胚胎植入前基因檢測可以在胚胎移植入子宮之前，將其中的部分細胞取出進行植入前遺傳學診斷或植入前遺傳學篩查。胚胎植入前遺傳學診斷能夠較好地對已知缺陷進行檢測，例如當父母一方攜帶有突變位點或基因重組時，能夠檢測到胚胎的特定位點突變或染色體重排；而胚胎植入前遺傳學篩查則更廣泛地應用于篩查染色體非整倍體現象，特別是高齡產婦以及習慣性流產患者。本文針對胚胎植入前基因檢測的現行技術及新技術進行綜述，并從社會和人文角度對該技術的應用進行展望和思考。

1 植入前基因檢測的概述

自1978年首例應用體外受精技術的嬰兒出生以來，為了不斷提高受孕率，人們開發出各種輔助生殖技術，如胞漿內單精子注射技術以及胚胎低溫保存技術等[2]。早期胚胎著床率和早孕率下降的主要原因是非整倍體比例的升高，研究表明，妊娠前3個月的流產中，非整倍體原因所致流產占50%[3]。因此，直接將整倍體胚胎移植入子宮能顯著提高著床率并降低流產率，植入前基因檢測應運而生。

植入前基因檢測的受試者通常是經過檢查后，有可能生育單基因缺陷風險嬰兒的夫婦。植入前遺傳學診斷通常對經由體外受精獲得的胚胎進行活檢，對胚胎中1個或多個細胞進行遺傳學分析，并最終選擇未受基因缺陷影響的胚胎進行移植。極體是卵母細胞兩次減數分裂的副產物，其中包含著多余的母源染色體，因此可通過極體對母源單基因遺傳缺陷進行檢測。伴隨著胚胎發育，還可以從卵裂階段的胚胎到囊胚階段的滋養外胚層細胞中取出1個或多個細胞進行活檢。而成熟的胚胎玻璃化冷凍和快速解凍技術，不僅能夠保證胚胎后續發育不受影響，還能對胚胎進行遺傳診斷和篩查，使得囊胚期胚胎活檢成為較為可靠的植入前基因檢測手段。

有研究者將植入前基因檢測細分為用于單基因疾病的胚胎植入前基因檢測(用于染色體非整倍體的胚胎植入前基因檢測)和用于染色體結構失衡的胚胎植入前基因檢測[4]，這使得植入前基因檢測的研究方向更為細致和深入。此外，植入前基因檢測技術的發展也離不開微量DNA遺傳和染色體分析技術發展，包括聚合酶鏈式反應(polymerase chain reaction，PCR)，熒光原位雜交(flourescence in situ hybridization,FISH)，以及包括單核苷酸多態性(single nucleotide polymorphisms,SNP)、陣列比較基因組雜交(array comparative genomic hybridisation,aCGH)以及“下一代”測序術(next-generation sequencing，NGS)等在內的微陣列技術。眾多分子生物學方法論的發展也推動著植入前基因檢測技術的快速成熟和穩定，使得檢測結果準確度不斷提高，檢測范圍和檢測深度也邁上新的階梯。

2 現行植入前基因檢測技術的優勢及劣勢

2.1 極體活檢 極體活檢是指在胚胎卵裂前取出第1次及第2次減數分裂所排出的極體，并進行遺傳學檢測。1990年，學界首次報道了臨床應用極體活檢技術對胚胎發育進行評估，并且該項技術對后續的著床率和卵裂期的胚胎發育無負面影響[5]。極體活檢通過取出極體對胚胎發育進行預測和評估，避免了從胚胎中取出細胞，具有一定的優勢。但由于該技術僅能分析母源染色體或基因，而無法對父源遺傳物質進行鑒定，因此具有一定的局限性。此外，極體活檢從單個胚胎中所獲取的遺傳物質數量極少，并且限制因素較多，例如PCR檢測過程中無法對等位基因進行評估，因此該項技術并未得到廣泛應用。

2.2 卵裂期(囊胚)活檢 胚胎細胞活檢是指在胚胎卵裂期，自6細胞胚胎至8細胞胚胎中取出1～2個細胞進行活檢。與極體活檢相比，胚胎細胞活檢可以同時分析母源和父源的遺傳物質，檢測范圍更廣。但由于遺傳物質數量過少，相關檢測受到了限制，如在卵裂期發生嵌合的概率高達60%[6-7]，而胚胎細胞活檢對嵌合現象的檢測準確性低等，因此容易產生誤診[8]。此外，在卵裂期取出個別細胞會延緩胚胎發育至囊胚期的時間，并可能由此導致著床率和受孕率下降[9-11]。

2.3 滋養外胚層活檢 世界上首例應用滋養外胚層活檢和囊胚期移植技術進行植入前基因檢測的嬰兒于2005年出生[12]。而隨著培養體系的不斷完善，囊胚期胚胎移植的受孕率顯著提高[13-14]。此外，經SNP技術進行序列分析，證實內細胞團與滋養外胚層遺傳特性高度一致[15]。因此，滋養外胚層活檢隨后被應用于臨床試驗中，并開始進行多細胞活檢，大大減少了誤差，保證了結果的準確性。盡管與卵裂期胚胎相比，囊胚期胚胎的嵌合率較低，但仍無法完全避免由嵌合引起的誤差[16]，且多數生殖中心無法在同一個體外受精周期內完成胚胎活檢、基因分析及移植[17]，因此在細胞被送往實驗室進行活檢分析期間，需要將囊胚進行冷凍保存，并在檢測完成后挑選適宜的胚胎進行移植，這在一定程度上增加了難度和成本。

3 植入前基因檢測新技術新方法的應用

早期的FISH是最先開始應用于囊胚活檢的方法，其利用對有限數量的染色體進行評估檢測，發現非整倍體現象[18-19]。而隨著單細胞全基因組擴增技術的快速發展及應用，使得同時對人類24條染色體進行量化檢測成為可能，即全染色體篩選技術。全染色體篩選技術包含SNP芯片技術、aCGH芯片技術、定量PCR技術和NGS技術。

3.1 SNP芯片技術 SNP芯片技術能夠在給定物種范圍內一次性大量檢測基因組DNA的單核苷酸多態性差異。一次芯片分析通常情況下能夠檢測到基因組中大約30萬個SNP位點，并通過與參考基因組對比，確定全部染色體范圍內的非整倍體、約250種常見結構畸變以及單親二倍體現象[19-20]。SNP芯片技術還可用于比較雜合位點上兩等位基因間的差異，從而實現高分辨率和高重復性分子細胞遺傳學檢測[20]。但SNP芯片仍存在一定的局限性，如僅能檢測5 Mb以下的染色體結構異常，無法檢測平衡染色體重排，以及無法檢測血親夫婦的基因異常(SNP位點純合)等[21-23]，而且從經濟角度考量，SNP芯片也較為昂貴。

3.2 aCGH芯片技術與傳統技術的比較 基因組雜交方法是將從囊胚中提取的DNA與正常對照組個體的DNA進行分離和熒光標記，并經過3～5 d的雜交后再進行分析比較。該技術隨后被aCGH芯片技術所取代，1個aCGH芯片中包含3 000～4 000個人類DNA片段，分辨率高達10 Mb，可檢測整條染色體以及大于10 Mb片段的非整倍體現象[20]。但aCGH芯片同樣存在局限性，它會剪切所有的染色體以匹配非整倍體狀態，而非染色體特異性剪切會產生假陽性結果。此外，由于可用于植入前基因篩查的DNA數量較少，會導致aCGH檢測的錯誤率達到2%～5%，但針對滋養外胚層活檢，應用aCGH技術仍能夠保證較高的敏感性(99.8%)和特異性(99.6%)[24-25]。

3.3 定量PCR技術 定量PCR技術是一種能夠快速鑒別24條染色體非整倍體的方法，在滋養外胚層活檢分析中得到了較為廣泛的應用[17，20]。該方法首先經過預擴增，隨后通過多重PCR技術，使每條染色體的每條臂至少擴增得到兩個序列。定量PCR的優勢在于分析時間可縮短至4 h，能夠在同一受精周期內進行活檢和胚胎移植。并且通過對各條染色體進行特異性剪切，具有較高的診斷準確度(98.6%)[17，24]；而經由比較基因組雜交檢測后，再使用定量PCR進行驗證，對整倍體胚胎的診斷錯誤率可低至0.21%[26]。現行定量PCR技術的局限性在于還未在囊胚和極體活檢樣本上得到運用，且同時進行檢測的樣本數量較少，并且無法檢測到片段性非整倍體[17，20]。

3.4 NGS技術 應用于植入前基因篩查的NGS技術包含全基因組DNA擴增建庫，PCR擴增前準備，以及輸入DNA的標記和片段化等[27]。應用NGS檢測染色體非整倍體的靈敏度可達100%，特異性可達99.98%[28]。同時經過aCGH和NGS檢測后，移植的整倍體囊胚臨床妊娠率和著床率分別達到63.8%和62.0%[27]。與aCGH技術相比，NGS成本較低，能夠同時對多樣本進行檢測，自動化程度極高，并且能夠對部分非整倍體和嵌合現象進行檢測。盡管NGS技術較為強大，但仍存在局限性，例如無法檢測到平衡染色體易位，以及由全基因組DNA擴增引起的片段性非整倍體現象。

3.5 核型定位技術 核型定位技術應用全基因組連鎖分析對夫婦雙方及已知遺傳性狀家庭成員間的SNP進行比對，以確定等位基因SNP位點與攜突變染色體間的關聯性[29]。核型定位技術無須等待家族特定候選基因探針的開發(3～4個月)，直接經全基因組擴增和基因分型，構建核型庫，隨即將胚胎基因型與參考基因組進行比較，由此確定是否受到親本攜突變遺傳的影響[30]。與PCR擴增相比，該技術成本較高，但由于時間短、自動化程度高，因而其運行成本與PCR差距不大[23]。

4 地區差異性與需求帶來的思考

我國幅員遼闊，人口基數巨大，遺傳性疾病的發病絕對人數極高，因此通過植入前基因檢測技術對植入前胚胎進行遺傳學檢測，對預防遺傳病，提高人口素質和國計民生具有重大意義。由于社會的快速發展和自然環境的不斷變化，近年來，各類遺傳病發病率呈現上升態勢，應用植入前基因檢測技術，能夠為有家族遺傳病史的夫婦提供臨床篩查服務，減少及阻斷單基因遺傳病的發生和世代遺傳，實現在基因層面上預防遺傳性疾病，對提高我國公共衛生水平具有重要意義。

自1990年第1例植入前基因檢測嬰兒成功誕生以來，該技術在公眾和學術領域一直存在爭議。來自醫學、社會科學及人文科學界的人士認為植入前基因檢測是人類優生的一種新形式，通過對植入前胚胎進行檢測和選擇，提供了一種超越產前診斷后終止妊娠的選擇機會。但另一部分學者認為，與20世紀的優生學不同，植入前基因檢測技術的應用與人類發展進程無關，更多的只是對個體及家庭因遺傳病所致痛苦的預防。在歐洲部分國家，監管機構對植入前基因檢測技術的應用進行了極為嚴格的管理，對受試夫婦的年齡、遺傳病史、意向等進行了嚴格的篩選[31-32]，意在應用植入前基因檢測技術幫助真正受遺傳病困擾的家庭，而非想借助該技術達成其個人目的和意愿的家庭，尤其是意在進行性別選擇的家庭。但這些人文倫理層面的篩選和甄別難度較大，且主觀性較高，在實際從業過程中具有較高的不可控性。

另一方面，地區發展水平的差異及由此帶來的經濟條件差異，也為植入前基因檢測技術的應用及初衷帶來了思考。與其他診療方法一樣，植入前基因檢測為受到遺傳疾病困擾的人群提供解決方案，能夠讓后代免受遺傳病困擾，但同時其高昂的檢測費用也成為其推廣應用的障礙之一。在美國，大多數醫療保險公司都不會承擔植入前基因檢測的費用。美國研究者在對遺傳病風險較高的18對夫婦進行訪談時發現，大多數夫婦表示植入前基因檢測的成本問題是最大的障礙[33]。有研究者在澳大利亞對50位接受植入前基因檢測的女性進行采訪時也發現，過高的檢測費用令接受檢測者擔憂，而其家庭收入均已高于當地平均水平[34]，但在地中海貧血高發國家(如沙特阿拉伯和伊朗等)，已對婚前育齡人群實行強制性的遺傳學篩查，以控制該遺傳病的發病。

針對上述兩方面的問題，在依靠社會和公眾力量，普及生殖知識，推廣優生優育理念的同時，也要推動立法，將重大遺傳缺陷的篩查和植入前基因檢測列入國家醫療保險，為經濟欠發達地區和遺傳病高發地區人民提供更多的優生優育選擇，為提高我國公共醫療衛生水平提供保障。

5 結 語

植入前基因檢測很大程度上擴展了體外受精和不孕不育的治療范圍，在解決生育問題的同時，能夠實現生育質量的提高，可以使胚胎不受雙親攜帶的遺傳病以及非整倍體所帶來的困擾。相較于非整倍體和嵌合體胚胎，整倍體胚胎著床率和妊娠率均較高，因此，該技術的應用也在一定程度上提高了生育率，保證了生育質量。結合植入前基因檢測和產前篩查診斷，能夠有效減少由遺傳病和非整倍體所導致的新生患兒缺陷和死亡的現象。

隨著技術水平的不斷提升，用于植入前基因檢測的遺傳學診斷方法也不斷擴展，針對不同的檢測需求，人們有了更多的選擇。相關技術的革新發展和生殖醫學研究的不斷深入，使得植入前基因篩查和植入前基因診斷的應用進一步擴大和深入，將為患者提供更高的診斷精確度。而伴隨國家經濟發展和區域協同發展的不斷擴展，地區經濟差異將進一步縮小，將來能夠為更多受遺傳病困擾的家庭提供經濟上的便利。