哈爾濱地區產ESBLs鮑曼不動桿菌流行病學和耐藥基因研究*

高春波，蘇麗菊，柴 淼，張 萌，鄭力輝

(哈爾濱市第一醫院檢驗科，黑龍江哈爾濱 150010)

鮑曼不動桿菌是引起院內感染的重要條件致病菌[1],可導致呼吸道感染、敗血癥、泌尿系感染、腦膜炎、腹膜炎等[2-5]。近年來，隨著抗菌藥物的廣泛應用和不合理使用，鮑曼不動桿菌對幾乎各類化學結構的臨床常用抗菌藥物呈現高度的天然固有耐藥性和獲得性耐藥性，多重耐藥的鮑曼不動桿菌已成為醫院感染的重要病原菌[6]。鮑曼不動桿菌耐藥機制非常復雜，其中產超廣譜β-內酰胺酶(ESBLs)是主要耐藥機制之一[7]。產ESBLs可導致對青霉素類、1～3代頭孢菌素、單環酰胺類藥物耐藥，部分還可水解第4代頭孢菌素，給臨床抗感染治療帶來了嚴峻挑戰[8]。因此，本研究探討哈爾濱地區的產ESBLs鮑曼不動桿菌流行情況及基因型，旨在控制其傳播并為該類抗菌藥物的合理使用提供參考。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1菌株來源 收集2017年4-7月哈爾濱地區2家綜合性三甲醫院(哈爾濱市第一醫院和哈爾濱醫科大學附屬第四醫院)臨床分離的鮑曼不動桿菌共190株。標本來自血液、痰液、肺泡灌洗液、分泌物等，剔除同一患者同一部位重復分離菌株。采用VITEK-2細菌鑒定分析儀進行鑒定。

1.1.2主要試劑 藥敏紙片：氨芐西林/舒巴坦、頭孢他啶、頭孢吡肟、哌拉西林、哌拉西林/他唑巴坦、頭孢哌酮/舒巴坦、阿米卡星、環丙沙星、亞胺培南、美羅培南、米諾環素、替加環素、復方磺胺甲噁唑、慶大霉素均購自英國Oxiod公司。血瓊脂培養基、MH培養基均購自鄭州安圖生物有限公司，聚合酶鏈反應(PCR)試劑盒購自Takara大連寶生物工程有限公司，引物由上海生物工程公司合成。脈沖場級瓊脂糖購自美國Bio-Rad 公司，溴乙錠購自上海Sangon公司，PMSF購自Merk 公司。

1.2方法

1.2.1藥敏試驗及ESBLs菌株篩選 采用K-B紙片擴散法測定鮑曼不動桿菌對以上14種抗菌藥物的敏感性及進行ESBLs菌株篩選。質控菌株為大腸埃希菌ATCC25922和銅綠假單胞菌ATCC27853，購自國家衛生健康委員會臨床檢驗中心。結果參照美國臨床實驗室標準化委員會(CLSL)2017年版標準進行判讀。

1.2.2基因檢測 采用PCR法擴增主要的ESBLs編碼基因，包括PER-1、SHV-1、TEM-1、VEB、CTX-M、OXA-23基因型。引物設計參考文獻報道[9]，反應總體積為25.0 μL，包括0.2 μL Taq酶5 U/μL，含MgCl2的2.5 μL 10×緩沖液，2.5 μL dNTP，上下游引物各1.0 μL，3.0 μL DNA模板，14.8 μL ddH2O。擴增產物用2%瓊脂糖凝膠電泳。PCR產物測序由上海生工有限公司完成。測序結果在Gen Bank網上進行序列比對。

1.2.3脈沖場凝膠電泳(PFGE)分析菌株同源性

1.2.3.1制備染色體DNA 將菌株配至4 麥氏濃度菌懸液，取2 mL 菌懸液12 000 r/min離心2 min，棄上清，取300 μL 細菌懸濁液于1.5 mL eppendorf管中，平衡至50 ℃;加入50 ℃等體積2% Clean-cut 瓊脂糖凝膠，充分混勻并迅速灌注模具，4 ℃冰箱中凝固20 min。將膠塊置于離心管中，加入溶菌酶液，37 ℃水浴箱孵育2 h，吸出溶菌酶液，無菌水清洗膠塊2次，然后加入蛋白酶K液(終濃度0.8 mg/mL)，50 ℃水浴箱中孵育24 h。清洗膠塊，吸掉蛋白酶K液，加1×TE緩沖液1 mL，室溫下輕輕振蕩30 min。吸出清洗液，加入1 mL酶終止液(PMSF，濃度為1 mmol/L)滅活剩余的蛋白酶K，室溫下輕輕振蕩30 min。再加TE液重復清洗3次，每次30 min，4 ℃保存備用。

1.2.3.2細菌DNA限制性酶切 加入40 U限制性內切酶Apa Ⅰ、10×內切酶切緩沖液、0.1%牛血清白蛋白(BSA)12 μL，加入去離子水至120 mL，37 ℃水浴箱中孵育過夜。

1.2.3.3加樣和電泳 用0.5×TBE緩沖液配制1%的PFGE級瓊脂糖膠，在電泳槽中加入2 L TBE緩沖液，將消化好的細菌膠塊小心放入梳孔中，在空隙處加入融化的瓊脂糖凝膠進行密封。電泳條件為14 ℃,電場強度6 V/cm,脈沖角120度，脈沖時間15 s,電泳時間20 h。電泳結束后，用0.25 mg/L的EB染色液染色30 min，蒸餾水清洗30 min，最后對結果進行圖像采集。

1.2.3.4PFGE結果判定 PFGE分子分型依據美國疾病控制和預防中心(CDC)TENOVER等[9]推薦的方法判讀。圖譜完全相同的定義為一個型，彼此之間相差一個帶的定為同一型的不同亞型，相差2～3個帶的認為親緣關系密切，相差4～6個帶的認為可能相關，條帶相差7個及以上的認為無親緣關系。并隨機選擇不同的字母如A、B、C、D等的字母順序分型。

1.3統計學處理 采用WHONET5.6軟件統計，應用SPSS17.0統計軟件進行數據分析，計數資料以例數和率表示，組間率的比較采用χ2檢驗，P<0.05表示差異有統計學意義。

2 結 果

2.1鮑曼不動桿菌的耐藥性分析 190株鮑曼不動桿菌中，對米諾環素、替加環素、頭孢哌酮/舒巴坦敏感率最高，分別為95.3%、93.2%、56.8%。耐藥率高于70.0%的抗菌藥物為頭孢他啶和派拉西林，其余藥物耐藥率均高于50.0%。見表1。

表1 190株鮑曼不動桿菌對14種抗菌藥的藥敏結果(%)

2.2產ESBLs鮑曼不動桿菌的基因型 190株鮑曼不動桿菌中篩選出產ESBLs菌株共58株，檢出率為30.5%，PCR分析結果顯示PER-1基因型26株，TEM-1基因型23株，SHV-1基因型1株，OXA-23基因型24株，其中37.0%同時攜帶PER-1、TEM-1、OXA-23這3種基因型。其余基因型檢測結果為陰性。

2.3PFGE同源性分析 通過分析PFGE電泳圖譜，58株產ESBLs鮑曼不動桿菌主要分為5型，分別用A、B、C、D、E表示，來自哈爾濱市第一醫院的39株產ESBLs鮑曼不動桿菌菌株分為A、B、C型，以A型為主，為35株，其中A1亞型有27株，A2亞型有5株，A3亞型有3株；B型有3株；C型有1株。哈爾濱醫科大學附屬第四醫院的19株產ESBLs鮑曼不動桿菌中，5株與哈爾濱市第一醫院A1條帶一致；12株為D型，其中D1亞型9株，D2亞型3株；2株為E型。

3 討 論

鮑曼不動桿菌為非發酵革蘭陰性桿菌，該菌在醫院的環境中分布很廣且可長期存活，對危重患者威脅很大，可引起全身系統各個器官的感染，是引起院內感染高發病率和病死率的重要原因[10]。近年來，由于抗菌藥物的廣泛應用和抗菌藥物的濫用，多重耐藥性鮑曼不動桿菌日益嚴峻，尤其是ESBLs介導的β-內酰胺類抗菌藥物耐藥，給臨床治療帶來極大困難[11]。本研究中，在分離的190株鮑曼不動桿菌中，對米諾環素、替加環素、頭孢哌酮/舒巴坦敏感率最高，分別為95.3%、93.2%、56.8%。耐藥率高于70.0%的抗菌藥物為頭孢他啶和派拉西林，其余藥物耐藥率均高于50.0%，耐藥情況比較嚴重。

近年來，鮑曼不動桿菌院內感染和耐藥性已成為全球性防治難題[12]。研究表明，隨著廣譜β-內酰胺類抗菌藥物在臨床的廣泛應用和抗菌藥物使用模式的不同，近年來，又出現了許多新的β-內酰胺類耐藥基因型，且因地域不同，特點也不盡相同[13-15]。本研究發現，本地區鮑曼不動桿菌中ESBLs基因檢出率為30.5%(58株)，其中，以PER-1基因型為主，檢出26株，證實PER-1型在本地區為流行株。37.0%同時攜帶PER、TEM、OXA-23 基因型。

PFGE技術是近年來發展起來的一種重要的分離大分子量線性DNA的電泳技術[16]。在普通的凝膠電泳中，大的DNA分子(>10 kb)移動速度接近，很難分離形成足以區分的條帶，PFGE的發明正好解決了這一難題，它可以用來分離大小從10 kb到10 Mb的DNA分子，具有高分辨力、重復性好的優點，使PFGE的應用范圍已涉及到幾乎所有生物基因組結構的研究，并被譽為細菌分子學分型技術的“金標準”[17]。 本研究采用PFGE技術對本地區產ESBLs鮑曼不動桿菌進行流行病學分析。通過分析PFGE電泳圖譜，58株產ESBLs鮑曼不動桿菌主要分為5個克隆株，A1型為主要克隆株，在醫院內、醫院間傳播，成為本地區鮑曼不動桿菌不斷增加，耐藥率不斷上升的原因。因此，加強對鮑曼不動桿菌耐藥監測，及時發現和隔離，規范抗菌藥物的使用和管理，做好院內感染，有效預防和控制本地區耐藥菌株的產生及傳播，具有很重要的意義和價值。

綜上所述，哈爾濱地區鮑曼不動桿菌耐藥情況嚴重。鮑曼不動桿菌菌株產ESBLs酶是耐β-內酰胺類抗菌藥物的主要原因。產ESBLs鮑曼不動桿菌以PER-1基因型為主，本地區鮑曼不動桿菌流行株存在醫院之間交叉感染現象。