APN、MMP-9、PLGF的表達(dá)水平與重度子癇前期發(fā)病的關(guān)系研究

蔣 韜,潘建海

(湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬隨州醫(yī)院婦產(chǎn)科,湖北隨州 441300)

子癇前期是指妊娠期對母嬰均造成危害的特發(fā)疾病，孕婦在妊娠20周后，表現(xiàn)出血壓升高、尿蛋白增加、水腫以及器官損傷[1]。子癇前期發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，目前研究認(rèn)為其發(fā)病原因可能與異常血管重鑄、血管內(nèi)皮細(xì)胞功能異常、脂代謝紊亂等有關(guān)[2]。脂聯(lián)素(APN)是由成熟脂肪細(xì)胞分泌的蛋白，具有抗炎，改善胰島素抵抗，保護(hù)血管內(nèi)皮等作用[3]。基質(zhì)金屬蛋白酶-9(MMP-9)是一種可消化細(xì)胞外基質(zhì)的蛋白水解酶，與滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲力、重建螺旋動脈有關(guān)[4]。胎盤生長因子(PLGF)具有促進(jìn)滋養(yǎng)細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞增殖作用[5]。結(jié)合子癇前期發(fā)病機(jī)制，認(rèn)為APN、MMP-9和PLGF可能參與子癇前期發(fā)病。本研究旨在分析胎盤組織中APN、MMP-9和PLGF表達(dá)水平，探討其與重度子癇前期發(fā)病的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2016年4月至2017年3月在本院住院分娩的重度子癇前期孕婦110例為觀察組，觀察組患者均符合重度子癇前期診斷標(biāo)準(zhǔn)[6]，排除伴有產(chǎn)科其他并發(fā)證以及有原發(fā)病患者。另選取同期在本院住院分娩110例血壓正常孕婦為對照組。兩組孕婦在年齡、孕次以及產(chǎn)次方面，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，孕婦體質(zhì)量指數(shù)(BMI)以及新生兒體質(zhì)量方面差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，一般資料見表1。兩組患者均知情同意，本研究經(jīng)本院倫理委員會批準(zhǔn)同意。

表1 兩組一般資料比較

1.2標(biāo)本收集 胎盤娩出后，立刻在胎盤中心取一小塊胎盤組織，注意避開肉眼可見壞死處和鈣化處。生理鹽水洗凈后，將其分為兩部分，一部分迅速采用10%甲醛溶液浸泡，然后石蠟包埋，待行免疫組化檢測；另一部分迅速置入液氮罐內(nèi)，隨后轉(zhuǎn)入-80 ℃冰箱，待行熒光定量PCR檢測。

1.3熒光定量PCR檢測方法 胎盤組織經(jīng)Trizol溶液(北京康為世紀(jì)生物科技有限公司)裂解后，采用總RNA提取試劑盒[天根生化科技(北京)有限公司]提取胎盤組織RNA，提取步驟參照試劑盒說明書。然后參照SuperRT cDNA 試劑盒(北京華夏遠(yuǎn)洋科技有限公司)說明書步驟進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。熒光定量PCR引物由上海生工生物工程有限公司合成，引物序列見表2。熒光定量PCR反應(yīng)體系20.0 μL∶2×UltraSYBR Mixture 10.0 μL，上游引物0.4 μL,下游引物0.4 μL,DNA模板0.8 μL，RNase-Free Water補足20.0 μL。熒光定量PCR反應(yīng)條件：95 ℃ 10 min，隨后95 ℃ 15 s，55 ℃ 60 s重復(fù)40個循環(huán)，最后升溫至95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，95 ℃ 15 s，60 ℃ 15 s。每個樣本至少設(shè)置3個重復(fù)孔。

表2 熒光定量PCR引物序列

1.4免疫組化檢測方法 將石蠟標(biāo)本切片，厚度約為5 μm，常規(guī)脫蠟水化，采用3% 過氧化氫封閉10 min后，微波修復(fù)抗原。然后采用5%牛血清清蛋白(BSA)封閉30 min，加單克隆抗體(一抗)低溫孵育過夜。次日，用磷酸緩沖鹽溶液(PBS)清洗3次后，加入羊抗鼠二抗、SABC室溫孵育30 min，PBS清洗3～5次后，進(jìn)行DAB顯色。復(fù)染1 min后脫水、透明、封片。采用Olympusix-71倒置熒光顯微鏡(日本)觀察，細(xì)胞質(zhì)或者細(xì)胞核呈棕黃色視作陽性表達(dá)。在400倍鏡下取5個視野，采用MPIAS-500計算機(jī)圖像分析處理系統(tǒng)進(jìn)行積分光密度分析。

2 結(jié) 果

2.1兩組胎盤組織APN、MMP-9和PLGF mRNA 表達(dá)比較 觀察組胎盤組織APN mRNA表達(dá)顯著高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，觀察組胎盤組織MMP-9和PLGF mRNA表達(dá)量顯著低于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表3。

表3 兩組胎盤組織APN、MMP-9和PLGF mRNA 表達(dá)比較

2.2兩組胎盤組織APN、MMP-9和PLGF蛋白表達(dá)比較 觀察組胎盤組織APN蛋白表達(dá)顯著高于對照組(P<0.05)，觀察組胎盤組織MMP-9和PLGF 蛋白表達(dá)量顯著低于對照組(P<0.05)，見表4。

表4 兩組胎盤組織APN、MMP-9和PLGF蛋白表達(dá)比較

表5 胎盤組織APN mRNA與MMP-9 mRNA、 PLGF mRNA等相關(guān)性分析

2.3相關(guān)性分析 胎盤組織APN mRNA與MMP-9 mRNA、PLGF mRNA和新生兒體質(zhì)量呈負(fù)相關(guān)，與孕婦BMI呈正相關(guān)，見表5。胎盤組織MMP-9 mRNA與PLGF mRNA和新生兒體質(zhì)量呈正相關(guān)，與孕婦BMI呈負(fù)相關(guān)，見表6。胎盤組織PLGF mRNA與新生兒體質(zhì)量呈正相關(guān)，與孕婦BMI呈負(fù)相關(guān)，見表7。APN、MMP-9、PLGF的mRNA均與年齡無關(guān)。

表6 胎盤組織MMP-9 mRNA與PLGF mRNA等相關(guān)性分析

表7 胎盤組織PLGF mRNA與年齡等相關(guān)性分析

3 討 論

子癇前期是妊娠期女性以高血壓和蛋白尿為主要特征的內(nèi)科疾病，其發(fā)病是因胎盤血流灌注不足所引起。胎盤絨毛滋養(yǎng)細(xì)胞受損，侵襲能力減弱，子癇前期中子宮螺旋動脈被限制于子宮蛻膜層表面，導(dǎo)致部分血管重鑄失敗，胎盤灌注減少，出現(xiàn)缺血缺氧現(xiàn)象，影響胎兒發(fā)育。同時滋養(yǎng)細(xì)胞分泌的大量細(xì)胞因子進(jìn)入母體血液循環(huán)系統(tǒng)，導(dǎo)致內(nèi)皮功能損傷，從而引發(fā)子癇前期臨床癥狀[7]。

APN是由成熟脂肪細(xì)胞分泌的具有多種生物活性的蛋白質(zhì)，通過與AdipoR1和AdipoR2兩種跨膜轉(zhuǎn)運受體相互作用而發(fā)揮作用，具有抗炎、抗動脈粥樣硬化、抗栓、抗氧化作用，并可參與機(jī)體代謝、骨生成、抗腫瘤過程。另外，APN可促進(jìn)NO合成，有助于子癇前期孕婦血壓調(diào)節(jié)以及血管功能保護(hù)[8-9]。MMP是一組可將細(xì)胞外基質(zhì)降解的內(nèi)切酶，與胎盤形成和子宮螺旋動脈重構(gòu)密切相關(guān)，MMP-9即明膠酶B，可選擇性浸潤子宮內(nèi)膜，利于胎盤著床，是胎盤形成最重要的因子之一[10]。且有研究表明，MMP-9與滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲力以及血管生成有關(guān)[11]。PLGF是血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)家族中的一員，包含PLGF-1、PLGF-2、PLGF-3、PLGF-4共4個亞型，前兩者是發(fā)揮生理效應(yīng)的主要亞型。PLGF可促進(jìn)滋養(yǎng)細(xì)胞增殖、遷移，抑制滋養(yǎng)細(xì)胞凋亡，同時增強(qiáng)VEGF活性，促進(jìn)NO釋放，有助于胎盤生長[12]。由于APN、MMP-9和PLGF均與滋養(yǎng)細(xì)胞功能調(diào)節(jié)或血管內(nèi)皮細(xì)胞功能調(diào)節(jié)相關(guān)，所以推測他們可能參與子癇前期的發(fā)生。

本研究對重度子癇前期孕婦以及健康孕婦胎盤組織中APN、MMP-9和PLGF的表達(dá)水平分別采用熒光定量PCR和免疫組化方法進(jìn)行檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，觀察組APN在mRNA和蛋白水平上的表達(dá)均顯著高于對照組，觀察組MMP-9、PLGF在mRNA和蛋白水平上的表達(dá)均顯著低于對照組，提示重度子癇前期孕婦胎盤組織APN表達(dá)量增多，而MMP-9、PLGF表達(dá)量降低。APN表達(dá)量升高可能是對患者機(jī)體抗血管生成、代謝變化以及炎性反應(yīng)的補償性反饋調(diào)節(jié)，與李園園[13]研究結(jié)果一致。但另有研究結(jié)果顯示，APN表達(dá)量在重度子癇前期孕婦胎盤組織內(nèi)明顯降低[14]，造成結(jié)果差異的原因可能與各研究檢測未區(qū)分APN亞型，而不同亞型間活性差異較大有關(guān)。MMP-9表達(dá)量降低會直接影響滋養(yǎng)細(xì)胞侵入以及子宮螺旋動脈重鑄，導(dǎo)致胎盤血流灌注不足，滋養(yǎng)細(xì)胞因缺血缺氧釋放有害因子，致使血管內(nèi)皮損傷，出現(xiàn)細(xì)小動脈痙攣等癥狀，與辛樂等[15]研究結(jié)果一致。PLGF表達(dá)量降低則使滋養(yǎng)細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞增殖分化能力降低，從而減少胎盤血管形成，進(jìn)一步損傷血管內(nèi)膜。同時PLGF表達(dá)量降低還會破環(huán)血管舒縮因子平衡，使細(xì)小動脈發(fā)生痙攣，胎盤缺血缺氧愈發(fā)嚴(yán)重，與楊麗萍等[16]對血清中PLGF檢測結(jié)果一致。

本研究通過相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，胎盤組織APN mRNA與MMP-9 mRNA和PLGF mRNA均呈負(fù)相關(guān)，推測APN升高和MMP-9、PLGF降低對血管生成平衡造成影響，使血管內(nèi)皮細(xì)胞受到損傷，共同參與重度子癇前期的發(fā)生和發(fā)展。而MMP-9 mRNA和PLGF mRNA呈正相關(guān)，提示兩者在重度子癇前期發(fā)病中具有協(xié)同作用。孕婦BMI與APN mRNA呈正相關(guān)，與MMP-9 mRNA和PLGF mRNA呈負(fù)相關(guān)，說明孕婦肥胖程度會影響子癇前期的發(fā)生，這可能與炎性反應(yīng)、氧化應(yīng)激等有關(guān)。新生兒體質(zhì)量與APN mRNA呈負(fù)相關(guān)，與MMP-9 mRNA和PLGF mRNA呈正相關(guān)，說明抗血管生成因子和促血管生成因子平衡失常等信號經(jīng)胎盤屏障傳達(dá)到胎兒，使胎兒生長發(fā)育受到影響，但具體機(jī)制還需進(jìn)一步探討。

4 結(jié) 論

重度子癇前期孕婦胎盤組織中APN表達(dá)升高，MMP-9和PLGF表達(dá)降低，三者可能通過影響血管生成平衡引起重度子癇前期發(fā)生，且新生兒體質(zhì)量與APN、MMP-9和PLGF相關(guān)，三者可能通過胎盤屏障對胎兒發(fā)育進(jìn)行調(diào)控。