核糖體結合蛋白1干擾慢病毒載體的構建及其對人肝癌細胞的干擾效應*

朱少美，劉集鴻，周 瀟

(惠州市第一人民醫院檢驗科，廣東惠州 516001)

肝癌是全球惡性腫瘤研究的熱點之一，具有高發病率、高病死率的特點，在男性中其發病率占第5位，病死率占第2位；在女性中其發病率占第9位，病死率占第6位[1]。我國是肝癌高發國家，肝癌發病人數占全球發病人數的55%，死亡人數僅次于肺癌，位居第2位[2]。在我國，引起肝癌發生的主要原因是乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV)[3]等病毒感染，病毒復制依賴宿主細胞，需與宿主蛋白，如核糖體結合蛋白1(RPN1)等相互作用。RPN1是內質網寡糖轉移酶的重要功能蛋白，協助初生蛋白進入粗面內質網并進行糖基化修飾[4-5]。有研究報道表明，黃頭病毒、登革病毒等感染宿主細胞后，RPN1蛋白表達增強并促進病毒感染[6-7]。因此，RPN1可能參與肝炎病毒引起的肝癌的發生、發展過程。本研究將利用RNA干擾技術，構建針對RPN1基因的RNA干擾慢病毒，感染肝癌細胞系，建立RPN1低表達的穩定細胞株，旨在進一步研究RPN1基因在肝炎病毒所致肝癌發生、發展中的分子機制，為其防治提供重要的實驗基礎。

1 材料與方法

1.1細胞與主要試劑 293T細胞和Huh7.5.1細胞是南方醫科大學生物技術學院饋贈，培養基為DMEM(Hyclone)和胎牛血清(上海微科生化試劑有限公司)。慢病毒載體系統：工具質粒GV248、病毒包裝輔助質粒(Helper 1.0)和病毒包裝輔助質粒(Helper 2.0)均由上海吉凱基因化學技術有限公司提供；引物序列合成與測序由英濰捷基(上海)貿易有限公司完成；限制性內切酶AgeⅠ和EcoRⅠ購自NEB公司；T4 DNA ligase購自Thermo Scientific公司；Taq Plus DNA polymerase購自南京諾唯贊生物科技有限公司；質粒提取試劑盒EndoFree midi Plasmid Kit購自天根生化科技(北京)有限公司。

1.2RNP1 RNA干擾慢病毒載體構建 針對RPN1(基因序列號NM_002950)序列，設計RNA干擾靶點：GAG GAA GAG AAC AAT TTG GAA，由此構建干擾序列，合成單鏈引物RPN1 RNA干擾-a和-b，見表1。合成的單鏈引物干粉溶解后，90 ℃水浴15 min退火，自然冷卻至室溫，合成雙鏈DNA引物。慢病毒載體GV248經AgeⅠ和EcoRⅠ 37 ℃ 3 h雙酶切成線性。T4 DNA ligase將雙酶切線性化的載體和退火雙鏈DNA連接過夜，轉化感受態大腸桿菌DH5α株，陽性克隆進行PCR鑒定。PCR鑒定引物序列，上游引物5′-CCA TGA TTC CTT CAT ATT TGC-′3，下游引物5′-ATG TCC TTC TGC TGA TAC TGG G-′3。反應條件：94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，循環22次；72 ℃ 5 min，最后冷卻至4 ℃。PCR鑒定陽性的克隆接種于含氨芐抗菌藥物的LB液體培養基中，37 ℃培養12～16 h，取適量菌液送測序公司進行測序。對測序結果與目的基因序列進行比對分析，比對正確的菌液進行質粒提取。

表1 RPN1 RNA干擾慢病毒載體構建框架序列

1.3RNA干擾慢病毒包裝與濃縮 將鑒定正確的RPN1 RNA干擾慢病毒質粒20 μg與病毒包裝輔助質粒(Helper 1.0)15 μg、病毒包裝輔助質粒(Helper 2.0)10 μg用脂質體瞬時轉染包裝細胞293T，轉染6 h后換10%血清培養基。轉染48 h后，觀察細胞形態和綠色熒光蛋白表達，收集293T細胞上清液。將上清液于4 ℃、4 000 g 離心10 min，用0.45 μm濾器過濾，用Beckman超速離心機 于4 ℃、25 000 r/min離心2 h，離心后，棄去上清，盡量去除殘留在管壁上的液體，加入病毒保存液重懸，-80 ℃保存。

1.4梯度稀釋法測定病毒濃度 將293T細胞鋪板按4×104細胞/孔鋪于96孔板。次日，將待測病毒取10 μL，加入90 μL無血清培養基，記為1E+1 μL，分別逐級10倍梯度稀釋至1E-6 μL。將細胞原培養基棄掉，加入病毒液，4 d后，觀察熒光表達情況并計算出現熒光但數量最少的孔中熒光細胞數，病毒滴度=熒光細胞數/病毒原液量，單位為TU/mL。

1.5RPN1 RNA干擾慢病毒在肝癌細胞的表達 在37 ℃、5%CO2條件下，肝癌細胞系Huh7.5.1培養于10%胎牛血清的DMEM培養基。將2×105/孔接種于6孔板中。實驗按10 MOI加入病毒進行感染，分為兩組：RPN1 RNA干擾慢病毒組和陰性對照組(NC，插入非相關序列的慢病毒，陰性對照插入序列為TTC TCC GAA CGT GTC ACG T)，感染后16 h換成完全培養基，72 h后用熒光顯微鏡觀察拍照。

1.6實時熒光定量PCR(RT-qPCR)測定病毒干擾效果 Trizol提取細胞RNA，通過RT-qPCR方法測定RPN1的表達，GAPDH為內參基因，逆轉錄和RT-qPCR檢測分別使用Promega的M-MLV試劑盒和TAKARA的SYBR Master Mixture試劑盒嚴格按說明書進行操作。引物序列：RPN1上游引物5′-GGA CCT ACT GGA TTA TGG G-′3，下游引物5′-GAT GGT CTT AAA AGA ACG GA-′3；GAPDH上游引物5′-TGA CTT CAA CAG CGA CAC CCA-′3，下游引物5′-CAC CCT GTT GCT GTA GCC AAA-′3。反應條件：95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，循環40次；95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，95 ℃ 15 s。結果采用ΔΔCt法進行相對定量分析。

2 結 果

2.1RPN1 RNA干擾慢病毒載體的鑒定 RPN1 RNA干擾雙鏈DNA引物與酶切線性化的慢病毒載體GV248連接后，轉化感受態細胞，陽性克隆進行PCR鑒定，見圖1。將PCR鑒定正確的陽性克隆培養后，取菌液測序，結果正確。

注：孔道1為陰性對照(ddH2O)；孔道2為陰性對照(空載體)；孔道3為Marker，自上而下依次為5.0 kb、3.0 kb、2.0 kb、1.5 kb、1.0 kb、750 bp、500 bp、250 bp、100 bp；孔道4～8為RPN1 RNA干擾轉化子。連接入RPN1 RNA干擾片段的陽性克隆PCR片段大小為534 bp，沒有連接入RPN1 RNA干擾片段的空載體克隆PCR片段大小為500 bp

圖1 RPN1 RNA干擾慢病毒載體PCR鑒定

2.2RPN1 RNA干擾慢病毒的包裝及滴度測定 RPN1 RNA干擾慢病毒感染293T細胞48 h后可觀察到明顯綠色熒光蛋白，收集病毒上清并濃縮，用梯度稀釋法測定病毒滴度為2×109TU/mL。病毒包裝成功。

2.3RPN1 RNA干擾慢病毒在Huh7.5.1細胞的表達 Huh7.5.1細胞感染 RPN1 RNA干擾慢病毒72 h后可檢測到綠色熒光蛋白，綠色熒光陽性率達90.0%以上，表明該慢病毒可在細胞內表達且表達率高。見圖2。

注：空白對照為未加慢病毒，naive Huh7.5.1細胞；陰性對照為加入了含對照序列的慢病毒的Huh7.5.1細胞； RPN1 RNA干擾慢病毒為加入了RPN1 RNA干擾慢病毒的Huh7.5.1細胞

圖2慢病毒感染Huh7.5.1細胞熒光圖

2.4RPN1 RNA干擾慢病毒的干擾效果 Huh7.5.1細胞感染 RPN1 RNA干擾慢病毒72 h后用RT-qPCR測定RPN1基因的干擾效果，見圖3，RPN1 RNA干擾慢病毒組RPN1 mRNA表達量為0.076±0.022，而對照組為1.007±0.006。相對于陰性對照，RPN1 RNA干擾慢病毒組RPN1基因表達明顯下降(t=69.788，P<0.05)，敲減效率達到92.4% ，表明成功干擾了RPN1基因的表達。

注：陰性對照為加入了含對照序列的慢病毒的Huh7.5.1細胞；RPN1 RNA干擾慢病毒為加入了RPN1 RNA干擾慢病毒的Huh7.5.1細胞

圖3 RPN1基因在Huh7.5.1的表達

3 討 論

RPN1是粗面內質網寡糖轉移酶的一部分，橫穿內質網膜腔內的氨基末端和細胞質內的羧基端，協助待加工蛋白進入粗面內質網，參與核糖體結合、新生蛋白跨膜易位及進一步修飾，有研究發現其表達與肺癌、甲狀腺癌等發生相關[8-10]，相對于健康組織，癌癥組織的表達明顯升高，而其與肝癌的關系尚不明確。原發性肝癌中約90%屬于肝細胞癌，而其中約80%是HBV或HCV的攜帶者[11]。病毒感染引起機體免疫系統活躍，在病毒與機體免疫系統相互抗爭過程中不可避免帶來持續性的慢性肝損傷，這是肝炎病毒引起肝癌的主要原因[12]。研究肝炎病毒的復制對控制肝炎病毒引起的肝癌至關重要。病毒與內質網上功能蛋白相互作用，從而介導病毒的復制增殖[13]。粗面內質網作為真核細胞中蛋白加工、折疊、糖基化修飾的主要場所，由于氧化應激、病毒感染等病理因素，未折疊蛋白或錯誤折疊蛋白聚集在內質網，容易誘發內質網應激效應[14]，而內質網應激效應在腫瘤的發生、發展中均發揮著十分重要的作用[15]。RPN1是粗面內質網內質網寡糖轉移酶最重要的功能蛋白，可以與肝炎病毒引起的內質網應激效應相關，參與肝炎病毒的復制并導致肝癌的發生，而目前尚無任何文獻報道，其基因功能尚未清晰。

RNA干擾是正常生物體內抑制特定基因表達的一種現象，利用該現象建立了RNA干擾技術，該技術可以快速、特異、高效沉默特定的基因片段，是目前研究基因功能的有效手段[16-17]。RNA干擾效應常用的有小干擾RNA(siRNA)和短發夾RNA(shRNA)。siRNA制備簡單，其轉染具有瞬時性。而shRNA是具有兩個短的反向重復序列的RNA，具有高效性和可持續復制等優勢，近年來更多應用于基因沉默表達的相關研究中[18-19]。質粒載體轉染細胞表達率低，不能持續性表達，而慢病毒或者腺病毒感染具有操作容易、感染效率高、穩定性好等優勢，尤其在腫瘤細胞等惰性細胞中仍具有較高的轉染率[20]，在RNA干擾技術中越來越受到重視。針對靶基因，設計shRNA慢病毒載體，包裝病毒進行感染實驗，是目前RNA干擾的常用策略。本研究為了探索RPN1與肝癌發生、發展的關系，選用的是目前體外廣泛應用的肝癌細胞系Huh7.5.1，通過構建針對RPN1基因的shRNA載體，構建干擾慢病毒，在該細胞下調該基因的表達，為該基因的研究提供很好的實驗基礎。本研究中，針對RPN1的shRNA質粒易于構建，PCR結果鑒定顯示構建成功。并通過輔助質粒共轉染系統成功在293T細胞上進行病毒包裝，濃縮的病毒滴度高達109TU/mL以上，高于文獻報道的其他慢病毒載體的感染病毒滴度[21-22]，表明該慢病毒感染系統包裝效率高。同時該構建的慢病毒感染肝癌細胞的陽性率高達90.0%以上，熒光定量檢測RPN1表達量發現其敲減效率達到92.4%，敲減效果明顯，表明選取的針對目的基因序列的干擾作用明顯，并且該慢病毒干擾體系十分有效。

4 結 論

綜上所述，應對RPN1可能與肝癌的發生、發展關系密切，但尚未明確這一研究現狀，本研究構建針對RPN1基因的shRNA感染慢病毒載體，利用輔助質粒共轉染系統成功包裝高滴度的干擾慢病毒，感染人肝癌細胞系Huh7.5.1并確定了其干擾效應，建立了RPN1低表達的穩定細胞株，將為進一步研究RPN1基因在肝癌發生、發展中分子機制的研究奠定重要的實驗基礎。