乙醛脫氫酶2基因G487A位點(diǎn)多態(tài)性與老年2型糖尿病患者冠狀動(dòng)脈狹窄及其嚴(yán)重程度的關(guān)系研究

吳和弟，許麗娃，吉家釵，陳訓(xùn)春，王少津

乙 醛 脫 氫 酶（aldehyde dehydrogenase，ALDH）是乙醇代謝過(guò)程中的關(guān)鍵酶，由多個(gè)分子組成，其中ALDH2是肝臟中與乙醛有最低km值（3 μmol/L）的活性最強(qiáng)的同工酶［1］。飲酒后乙醇主要在肝臟進(jìn)行代謝，其代謝途徑為乙醇-乙醛-乙酸-乙酰輔酶A-三羧酸循環(huán)［2］，代謝過(guò)程中乙醇脫氫酶（ADH）催化乙醇氧化為乙醛，ALDH催化乙醛氧化為乙酸。既往研究表明，ALDH2基因多態(tài)性與蒙古人酒精耐受性有關(guān)［3］。CARLSSON等［4］研究表明，ALDH2基因多態(tài)性與2型糖尿病（T2DM）有關(guān)。MURATA等［5］研究表明，ALDH2基因多態(tài)性影響T2DM患者血糖。目前，有關(guān)ALDH2基因多態(tài)性與T2DM患者冠狀動(dòng)脈狹窄關(guān)系的研究報(bào)道較少。本研究旨在探討ALDH2基因G487A位點(diǎn)多態(tài)性與老年T2DM患者冠狀動(dòng)脈狹窄及其嚴(yán)重程度的關(guān)系，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2015年10月—2016年10月海口市人民醫(yī)院收治的老年T2DM并冠狀動(dòng)脈狹窄患者60例作為研究組，另選取同期老年T2DM患者54例作為對(duì)照組，參照《2011年美國(guó)糖尿病學(xué)會(huì)糖尿病醫(yī)學(xué)診治標(biāo)準(zhǔn)》中的T2DM診斷標(biāo)準(zhǔn)［6］，以冠狀動(dòng)脈造影顯示冠狀動(dòng)脈狹窄率≥50%定義為冠狀動(dòng)脈狹窄。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）年齡≥60歲；（2）無(wú)嗜酒史。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）近半年內(nèi)發(fā)生急性腦血管疾病、嚴(yán)重創(chuàng)傷者；（2）有冠狀動(dòng)脈介入治療史者；（3）合并嚴(yán)重肝、腎功能不全者；（4）合并血液系統(tǒng)疾病者。本研究經(jīng)海口市人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)，所有患者知情并簽署知情同意書。

1.2 觀察指標(biāo)

1.2.1 一般資料 收集兩組患者一般資料，主要內(nèi)容包括性別、年齡、體質(zhì)指數(shù)（BMI）、吸煙情況、飲酒量及飲酒面紅反應(yīng)發(fā)生情況。以連續(xù)或累積吸煙≥6個(gè)月定義為吸煙；飲酒量以drink為單位，白酒44 ml、紅酒118 ml、啤酒355 ml為1 drink［7］；飲酒面紅反應(yīng)：飲酒或引用含乙醇飲料后面部迅速變紅。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)室檢查指標(biāo) 采集兩組患者肘靜脈血3 ml，室溫靜置20 min，2 500 r/min離心15 min（離心半徑10 cm），收集上層血清并置于-80 ℃冰箱中保存待測(cè)。采用美國(guó)雅培C16000全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)血清總膽固醇（TC）、三酰甘油（TG）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）及纖維蛋白原（FIB）。

1.2.3 基因多態(tài)性 采集兩組患者肘靜脈血3 ml，置于含乙二胺四乙酸（EDTA）抗凝管中搖勻，2 500 r/min離心5 min（離心半徑10 cm），分離上層血漿并置于-80 ℃冰箱中密封保存。采用吸附柱法提取基因組DNA并進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）擴(kuò)增反應(yīng)，ALDH2基因G487A位點(diǎn)引物序列由生工生物工程（上海）股份有限公司合成：上游引物：5'-GTCAACTGCTATGATGTGTTTGG-3'，下游引物：5'-CCACCAGCAGACCCTCAA-3'。PCR 反應(yīng)體系 50 μl：2 μl樣本DNA溶液，25 μl ALDH2擴(kuò)增液，引物各2 μl，雙蒸水補(bǔ)充至50 μl。PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性3 min，94 ℃變性45 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，共進(jìn)行35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸5 min。取擴(kuò)增產(chǎn)物200 bp，采用2%瓊脂糖凝膠電泳分離擴(kuò)增產(chǎn)物，溴化乙錠染色，紫外線分析凝膠成像系統(tǒng)下觀察電泳結(jié)果，將出現(xiàn)清晰單一目標(biāo)條帶的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送至海南華大基因生物科技有限公司進(jìn)行基因片段測(cè)序。

1.2.4 冠狀動(dòng)脈造影 采用Judkins法行冠狀動(dòng)脈造影，右冠狀動(dòng)脈造影投照左前斜、正位+頭部2個(gè)體位，左冠狀動(dòng)脈造影投照左前斜+頭位、左前斜+足位、右前斜+頭位、右前斜+足位、正位+頭位5個(gè)體位。由兩位有經(jīng)驗(yàn)的醫(yī)師分析冠狀動(dòng)脈造影光盤，根據(jù)冠狀動(dòng)脈病變支數(shù)分為單支病變、雙支病變及三支病變；采用Gensini積分評(píng)估冠狀動(dòng)脈狹窄程度，Gensini積分標(biāo)準(zhǔn)：冠狀動(dòng)脈狹窄率≤25%記1分，26%～50%記2分，51%～75%記4分，76%～90%記8分，91%～99%記16分，100%記32分；冠狀動(dòng)脈分支評(píng)分為狹窄率評(píng)分乘以各節(jié)段系數(shù)：左主干×5，左前降支近段×2.5、中段×1.5、遠(yuǎn)段×1，第一對(duì)角支×1，第二對(duì)角支×0.5，左回旋支近段×2.5、鈍緣支×1、遠(yuǎn)段×1.5、后降支×1、后側(cè)支×0.5，右冠狀動(dòng)脈近段×1、中段×1、遠(yuǎn)段×1、后降支×1。各節(jié)段評(píng)分之和為Gensini積分。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 23.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，計(jì)量資料以（x± s）表示，組間比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料分析采用χ2檢驗(yàn)；老年T2DM患者冠狀動(dòng)脈狹窄的影響因素分析采用多因素Logistic回歸分析，基因型與老年T2DM并冠狀動(dòng)脈狹窄患者Gensini積分、冠狀動(dòng)脈病變支數(shù)的相關(guān)性分析采用Spearman秩相關(guān)分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組患者一般資料和實(shí)驗(yàn)室檢查指標(biāo)比較 兩組患者性別、年齡、BMI、吸煙率及血清TC、TG、LDL-C、HDL-C、FIB水平比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；研究組患者飲酒量大于對(duì)照組，飲酒面紅反應(yīng)發(fā)生率高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，見表1）。

2.2 兩組患者基因型及等位基因分布頻率比較 兩組患者基因型及等位基因分布頻率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，見表2）。

2.3 多因素Logistic回歸分析 將冠狀動(dòng)脈狹窄作為因變量，將飲酒量、飲酒面紅反應(yīng)及基因型作為自變量（變量賦值見表3）進(jìn)行多因素Logistic回歸分析，結(jié)果顯示，飲酒量、飲酒面紅反應(yīng)及基因型是老年T2DM患者冠狀動(dòng)脈狹窄的獨(dú)立影響因素（P＜0.05，見表4）。

表2 兩組患者基因型及等位基因分布頻率比較〔n（%）〕Table 2 Comparison of genotypes and allele distribution frequencies between the two groups

表3 變量賦值Table 3 Variable assignment

2.4 不同基因型老年T2DM并冠狀動(dòng)脈狹窄患者Gensini積分和冠狀動(dòng)脈病變支數(shù)比較 不同基因型老年T2DM并冠狀動(dòng)脈狹窄患者Gensini積分和冠狀動(dòng)脈病變支數(shù)比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，見表5）。2.5 相關(guān)性分析 Spearman秩相關(guān)分析結(jié)果顯示，基因型與老年T2DM并冠狀動(dòng)脈狹窄患者Gensini積分（rs=0.451，P=0.042）、冠狀動(dòng)脈病變支數(shù)（rs=0.412，P=0.044）呈正相關(guān)。

表1 兩組患者一般資料和實(shí)驗(yàn)室檢查指標(biāo)比較Table 1 Comparison of general information and laboratory examination results between the two groups

表4 老年T2DM患者冠狀動(dòng)脈狹窄影響因素的多因素Logistic回歸分析Table 4 Multivariate Logistic regression analysis on influencing factors of coronary artery stenosis in elderly patients with T2DM

表5 不同基因型老年T2DM并冠狀動(dòng)脈狹窄患者Gensini積分和冠狀動(dòng)脈病變支數(shù)比較Table 5 Comparison of Gensini score and number of coronary artery lesions in elderly T2DM patients complicated with coronary artery stenosis with different genotypes

3 討論

ALDH是一種四聯(lián)體蛋白，目前已發(fā)現(xiàn)其共有19種同工酶，是多種醛類代謝的關(guān)鍵酶。突變型ALDH2基因第12外顯子發(fā)生G-A突變，導(dǎo)致487位氨基酸發(fā)生谷氨酸-賴氨酸的替換，使整個(gè)分子空間結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，進(jìn)而導(dǎo)致ALDH2酶活性喪失，乙醛代謝受抑制而使乙醛堆積［8-9］。研究表明，編碼ALDH2的基因具有多態(tài)性，野生型G487A具有催化活性，突變型G487A失去催化活性［10］。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，ALDH2基因多態(tài)性與心血管疾病有關(guān)，G487A等位基因突變可能與中國(guó)、韓國(guó)、日本人冠心病發(fā)病機(jī)制有關(guān)［11-12］；ALDH2對(duì)心肌缺血具有保護(hù)作用［13］；而攜帶ALDH2突變基因的T2DM患者血糖控制效果較差［5］，提示ALDH2基因在冠心病和T2DM發(fā)病中具有重要作用。但ALDH2基因多態(tài)性與老年T2DM患者冠狀動(dòng)脈狹窄的關(guān)系尚未完全明確。

本研究選取無(wú)嗜酒史患者，可排除短期內(nèi)飲酒導(dǎo)致乙醛堆積現(xiàn)象。本研究結(jié)果顯示，研究組患者飲酒量大于對(duì)照組，飲酒面紅反應(yīng)發(fā)生率高于對(duì)照組，且兩組患者基因型及等位基因分布頻率間有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，提示飲酒量、飲酒面紅反應(yīng)及ALDH2基因G487A位點(diǎn)多態(tài)性可能與老年T2DM患者冠狀動(dòng)脈狹窄的發(fā)生有關(guān)；進(jìn)一步行多因素Logistic回歸分析結(jié)果顯示，校正飲酒量、飲酒面紅反應(yīng)后，ALDH2基因G487A位點(diǎn)多態(tài)性是老年T2DM患者冠狀動(dòng)脈狹窄的獨(dú)立影響因素，分析原因可能如下：（1）突變型ALDH2基因活性降低，導(dǎo)致醛類堆積，炎性因子增加，促進(jìn)斑塊形成，進(jìn)而導(dǎo)致冠狀動(dòng)脈狹窄發(fā)生［14］；（2）ALDH2是硝酸甘油代謝的關(guān)鍵限速酶，ALDH2基因突變使硝酸甘油轉(zhuǎn)化為一氧化氮（NO）的過(guò)程受阻，導(dǎo)致血管擴(kuò)張作用減弱、血管內(nèi)皮功能紊亂，進(jìn)而促進(jìn)冠狀動(dòng)脈狹窄發(fā)生。本研究結(jié)果還顯示，基因型與老年T2DM并冠狀動(dòng)脈狹窄患者Gensini積分、冠狀動(dòng)脈病變支數(shù)呈正相關(guān)，提示ALDH2基因G487A位點(diǎn)多態(tài)性與老年T2DM患者冠狀動(dòng)脈狹窄嚴(yán)重程度有關(guān)。

綜上所述，ALDH2基因G487A位點(diǎn)多態(tài)性與老年T2DM患者冠狀動(dòng)脈狹窄及其嚴(yán)重程度有關(guān)。但本研究為單中心研究，且樣本量較小，所得結(jié)論仍有待聯(lián)合多中心、擴(kuò)大樣本量進(jìn)一步證實(shí)。

作者貢獻(xiàn)：吳和弟進(jìn)行文章的構(gòu)思與設(shè)計(jì)，數(shù)據(jù)收集、整理、分析，負(fù)責(zé)撰寫論文；吳和弟、許麗娃進(jìn)行研究的實(shí)施與可行性分析；吳和弟、吉家釵、陳訓(xùn)春進(jìn)行結(jié)果分析與解釋；王少津負(fù)責(zé)文章的質(zhì)量控制及審校，對(duì)文章整體負(fù)責(zé)，監(jiān)督管理。

本文無(wú)利益沖突。