化妝品中貝美格及其鹽類的高效液相色譜檢測及質譜確證

郭項雨，呂悅廣,2，陳 萌,3，王 春,4，孟憲雙，白 樺，馬 強

（1． 中國檢驗檢疫科學研究院，北京 100176；2． 中國科學院大學 化學與化工學院，北京 101407；3． 北京中醫藥大學 中藥學院，北京 100029；4． 南京農業大學 資源與環境科學學院，江蘇 南京 210095）

近年來，隨著生活節奏的加快和社會壓力的增加，人們的睡眠質量普遍下降[1]，進而導致在日常生活及工作中精神不夠飽滿，具有清爽、醒膚功能的化妝品越來越受到消費者的關注及青睞。3-乙基-3-甲基戊二酰亞胺（CAS 64-65-3）又稱貝美格，英文名bemegride，貝美格及其鹽作為一種中樞興奮劑，具有增強呼吸及興奮作用[2]，在醫學上具有廣泛的研究及應用[3-5]，但貝美格及其鹽具有遲發毒性，會引起情緒不安，精神錯亂、幻覺幻視等癥狀，添加在化妝品中會對人體健康造成潛在危害，我國《化妝品安全技術規范》（2015版）中明確規定化妝品中不得添加貝美格及其鹽[6]。

目前針對化妝品中禁用成分的檢測方法主要有高效液相色譜法（HPLC）[7-9]、高效液相色譜-質譜聯用法（HPLCMS）[10-13]、氣相色譜法（GC）[14,15]、氣相色譜-質譜聯用法（GC-MS）[16,17]、 超臨界流體色譜法（SFC）[18]及一些新型的快檢方法，如離子遷移譜法（IMS）[19.20]、原位電離質譜法（AIMS）[21]等。上述化妝品檢測方法涉及《化妝品安全技術規范》（2015版）中的禁用防腐劑、塑化劑、防曬劑、芳香劑及糖皮質激素等物質的測定，但尚未見化妝品中貝美格及其鹽類的測定方法報道。本研究開發建立了化妝品中貝美格及其鹽類的測定方法，對于確保化妝品質量安全和消費者健康安全具有積極意義。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

Agilent 1200型高效液相色譜儀（美國Agilent公司）；ACQUITY超高效液相色譜儀、Xevo TQ MS三重四極桿質譜儀、MassLynx數據處理系統（美國Waters公司）；Milli-Q超純水器（美國Millipore公司）；KQ-600B型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；CR 21G型高速冷凍離心機（日本Hitachi公司）。

貝美格（CAS 64-65-3，純度≥98%），德國Dr.Ehrenstorfe公司；甲醇和乙腈，色譜純，美國Fisher公司；其他試劑均為分析純。

1.2 標準溶液的配制

準確稱取貝美格標準品100 mg，置于100 mL容量瓶中，甲醇溶解并稀釋至刻度，配制成1 000 mg/L的標準儲備液。根據需要用甲醇稀釋成適用濃度的標準工作溶液。

1.3 樣品前處理

準確稱取1 g樣品（水劑類和洗面奶類直接稱取，乳液類樣品需加入2 g氯化鈉）于10 mL具塞離心管中，加入甲醇至刻度，超聲輔助提取20 min，以8 000 r/min離心15 min，上清液經0.45 μm微孔濾膜過濾后供高效液相色譜測定。

1.4 高效液相色譜條件

色譜柱：Symmetry C18（4.6 mm × 250 mm, 5 μm）；流動相：甲醇-水（50∶50, V∶V），等度洗脫；流速：1.0 mL/min；進樣量：10 μL；柱溫：30 ℃；檢測波長：210 nm。貝美格及其鹽類標準溶液的高效液相色譜圖見圖1。

圖1 貝美格及其鹽類標準溶液的高效液相色譜圖Fig.1 HPLC chromatogram of bemegride and its salts

1.5 高效液相色譜-串聯質譜確證條件

色譜條件：XBridge C18（2.1 mm × 150 mm, 3.5 μm）色譜柱；流動相：乙腈（A）和0.3%氨水溶液（B），等度洗脫（20∶80, V∶V）；流速：0.3 mL/min；進樣量：5 μL；柱溫：30 ℃。

質譜條件：電噴霧離子源；負離子模式；毛細管電壓：2.5 kV；萃取錐孔電壓：3.0 V；離子源溫度：150 ℃，脫溶劑氣溫度：500 ℃；脫溶劑氣流量：1 000 L/h，錐孔氣流量：50 L/h；多反應監測模式（MRM）。質譜分析參數見表1。

表1 貝美格及其鹽類的質譜分析參數Tab.1 Op timized MS/MS parameters for the analysis of bemegride and its salts

2 結果與討論

2.1 檢測波長的選擇

測定貝美格及其鹽類的最大紫外吸收波長，設定掃描范圍為200 ～ 400 nm。經測定，貝美格在210 nm處有最大吸收，因此設定它們的最大吸收波長為210 nm，貝美格標準溶液紫外吸收光譜圖見圖2。

圖2 貝美格標準溶液紫外吸收光譜圖Fig.2 Ultraviolet absorption spectra of bemegride

2.2 色譜柱的優化

分 別考察了不同品牌、不同鍵合相的色譜柱對貝美格及其鹽類保留行為，如Eclipse XDB C18（4.6 mm × 250 mm, 5 μm）、XTerra MS C18（4.6 mm × 250 mm, 5 μm）、Promosil C18（4.6 mm × 250 mm, 5 μm）、Symmetry C18（4.6 mm × 250 mm, 5 μm）和Kromasil C18（4.6 mm × 250 mm, 5 μm）。結果表明，選擇不同C18色譜柱對貝美格及其鹽類的色譜行為無明顯差異，因此選擇通用型C18（4.6 mm ×250 mm，5 μm）高效液相色譜柱均可，本方法選擇Symmetry C18（4.6 mm × 250 mm, 5 μm）進行后續實驗研究。

2.3 流動相的優化

分別選擇甲醇-水、乙腈-水作為流動相，比較不同流動相對貝美格及其鹽類色譜行為的影響。結果表明，采用甲醇-水作為流動相，貝美格的色譜峰峰型較好。在此基礎上，考察甲醇與水體積比為40∶60、45∶55、50∶50、55∶45、60∶40時對貝美格及其鹽類的色譜保留時間的影響。結果表明，當甲醇比例大于50%時，貝美格及其鹽類保留時間較弱，導致在實際檢測中發生嚴重的基質干擾現象。因此流動相最終優化結果為V（甲醇）∶V（水）=50∶50。

2.4 柱溫的優化

分別選擇柱溫為25 ，30 ，35 ℃，考察色譜柱溫度對貝美格及其鹽類的影響。結果表明，在各溫度下貝美格的色譜行為無明顯差異。根據不同地區氣候差異及各實驗室條件的不同，柱溫設定為30 ℃。

2.5 提取溶劑的選擇

比較甲醇和乙腈對貝美格及其鹽類提取效果的影響。篩選經測定不含貝美格及其鹽類的水劑類、洗面奶類和乳液類樣品作為空白樣品，向其中加入一定量貝美格標準溶液，充分混勻后進行提取。結果表明，用甲醇或乙腈進行提取，平行6次實驗，兩者提取率均可達到95%，提取效果無明顯差異。考慮到乙腈毒性較大，成本較高，選擇甲醇為提取溶劑。

2.6 質譜確證

由于化妝品配方中成分較多，基質復雜，而液相色譜-串聯質譜法具有更好的特異性和抗干擾能力，因此進一步開發了貝美格及其鹽類的高效液相色譜-串聯質譜確證方法。樣品經高效液相色譜法分析后，若疑似陽性樣品，采用高效液相色譜-串聯質譜法加以確證。在1.5確證條件下，經提取離子后，若出現154.2＞112.1和154.2＞138.1兩對離子對，并且離子對間相對豐度允許偏差在20%內，可確證樣品中含有貝美格。貝美格及其鹽類的質譜圖見圖3。

圖3 貝美格及其鹽類標準溶液的多反應監測質譜圖Fig.3 MRM chromatogram of bemegride and its salts

2.7 方法的線性范圍、檢出限和定量限

在本方法實驗條件下，貝美格及其鹽類的測定結果均以貝美格測定值計算。配制1 000 mg/L 的貝美格標準儲備液，甲醇將其稀釋至0.2、0.5、1、2、5、10、20、50 mg/L不同濃度標準工作液；以峰面積為縱坐標，相應貝美格濃度為橫坐標作圖，在以上濃度范圍內，貝美格及其鹽類線性方程為y=41.52x + 2.387，相關系數r2=0.999，呈良好的線性關系。以信噪比為3估算方法的檢出限（LOD），以信噪比為10估算方法的定量限（LOQ），貝美格的檢出限為0.2 mg/kg，定量限為0.5 mg/kg。

2.8 方法的回收率與精密度

分別稱取經測定不含貝美格及其鹽類的化妝品作為空白樣品，設定了0.5 mg/kg、5 mg/kg、50 mg/kg 3個添加濃度。待測樣液中貝美格及其鹽類含量應在標準曲線之內，超出線性范圍則應稀釋后再進行分析。按本檢驗方法所確定的實驗條件，對每個添加濃度對水劑類、膏霜類和乳液類樣品進行了6次實驗，結果見表2。由表2可知，回收率為 85.1% ～107.4%，精密度實驗測得相對標準偏差為3.7% ～ 9.3%。空白樣品添加貝美格標準溶液高效液相色譜圖見圖4。由圖4可知，所選空白樣品中的雜質不會對貝美格分離分析造成干擾。

表2 貝美格及其鹽的平均回收率及精密度結果（n=6）Tab.2 Results of recovery and precision for bemegride and its salts (n=6)

圖4 空白樣品添加貝美格標準溶液的高效液相色譜圖Fig.4 HPLC chromatogram of blank sample spiked with bemegride

2.9 實際樣品的測定

按照本研究建立的方法對市售、網購等多種途徑獲取的26件化妝品樣品進行了測定，其中水劑類樣品8件，洗面奶類樣品10件，乳液類樣品8件。結果表明，所測化妝品樣品中均未檢出貝美格及其鹽類。

3 結論

本研究建立了測定化妝品中貝美格及其鹽類的高效液相色譜檢測方法及高效液相色譜-串聯質譜確證方法。該方法準確、快速、靈敏度高，適用于化妝品中貝美格及其鹽類的測定。