非酒精性脂肪性肝病相關動物模型研究進展

沈李婷 陳東風 文良志

非酒精性脂肪性肝病(nonalcoholic fatty liver disease, NAFLD)已成為全球慢性肝病最主要的病因。隨著生活水平的提高，NAFLD的患病率呈逐年升高趨勢,在亞洲已達到25%[1]。NAFLD以無過量酒精攝入但出現肝細胞脂肪變為主要特征,通常伴隨有肝外代謝相關疾病，如肥胖，血脂異常，胰島素抵抗。大量的證據表明，NAFLD相關疾病包括非酒精性單純性脂肪肝(nonalcoholic simple fatty liver, NAFL)、非酒精性脂肪性肝炎(nonalcoholic steatohepatitis, NASH)、NAFLD相關肝硬化和肝癌(hepatocellular carcinoma, HCC)，還與心血管事件，慢性腎臟疾病，結直腸癌和其他肝外疾病的發生風險增加相關[2]。近年來，已有多種NAFLD動物模型應用于相關研究之中，我們對目前實驗研究中常用的動物模型進行了歸納分析，旨在為相關研究的動物模型選擇提供便利。

一、NAFLD動物模型

(一)高脂飲食(high-fat diet, HFD)HFD是誘導小鼠NAFLD的常用飲食。經典的HFD包含71%的脂肪，11%的碳水化合物和18%的蛋白質。動物總卡路里攝入量45%～75%來自脂肪。有文章報道，雄性小鼠用HFD喂養16周后，出現以下情況：①體質量增加；②肝細胞脂肪變性，表現為甘油三酯水平升高、肝細胞氣球樣變和Mallory小體形成；③高糖血癥和胰島素抵抗，表現為血清葡萄糖水平升高和胰島素水平升高[3]。因此，HFD喂養的動物模型能夠很好的模擬臨床NAFLD患者的發病機制和組織病理表現。但是該模型的缺點是耗時長(12～16周)，肝脂肪變性程度較輕，且很少出現炎癥及纖維化，難以構建NASH相關模型。除了常見的HFD誘導NAFLD小鼠模型外，還有自助餐飲食(cafeteria diet, CAF)用于構建NAFLD小鼠。

(二)自助餐飲食 CAF是一種參照西方文化，能夠模擬人類飲食習慣的方法，Brante P. Sampey等[4]分別通過CAF，基于45%豬油的HFD和正常飲食喂養雄性Wistar小鼠15周，觀察到CAF喂養的小鼠體質量增加程度，高糖血癥、高胰島素血癥和脂肪組織炎癥程度均重于HFD飲食和正常飲食小鼠。CAF模型與HFD模型相比，能更好的研究西方飲食結構下導致的肥胖及肥胖相關疾病的發病機制。

(三)瘦素缺失小鼠(ob/ob小鼠)Ob/ob小鼠也是常用于NAFLD研究的動物模型。瘦素由脂肪細胞產生，它參與下丘腦對攝食行為的調節，通過增加飽腹感以減少食物的攝入。Ob/ob小鼠因瘦素合成障礙，表現為懶惰、貪吃和過度肥胖，肝細胞出現脂肪變性，同時伴有高糖血癥、高脂血癥、高胰島素血癥和腸菌過度增殖。這類動物模型的缺點是在無外加條件下很難自發發生NASH和肝纖維化。最重要的是，在人類NAFLD中，血清瘦素通常呈現升高的狀態。因此，ob/ob小鼠需要一些外加刺激來模擬人類NAFLD/NASH發生，如予以ob/ob小鼠含果糖和膽固醇的高脂飲食，此時不但可以誘發肝臟的脂肪變性、炎癥和肝細胞氣球樣變，還可以導致肝纖維化發生[5]。

(四)瘦素受體缺失小鼠(db/db小鼠)db/db小鼠是常染色體隱性遺傳糖尿病基因(db)純合小鼠。 該小鼠表現為血清瘦素水平不同程度的升高但瘦素信號缺失。db/db小鼠生理及病理生理方面與ob/ob小鼠類似，通常用來構建NAFLD以及糖尿病模型。由于在正常飲食的情況下db/db小鼠不能自發出現NASH相關病理特征，因此，多數研究通常利用MCD飲食予以db/db小鼠第二次打擊來構建NASH。另有研究發現，予以db/db小鼠過量鐵負荷，使肝臟氧化應激，炎癥反應增加，促進肝臟炎性免疫細胞活性，影響肝細胞線粒體脂肪酸β氧化，最終使小鼠出現肝細胞氣球樣變和肝纖維化。即過量鐵負荷使db/db小鼠從NAFLD進展成NASH和相關纖維化[6]。

二、NASH動物模型

(一)甲硫氨酸-膽堿缺乏飲食(Methionine-and choline-deficient diet, MCD)MCD是構建NASH小鼠模型常用飲食，通常由蔗糖(40%的能量)和脂肪(10%)組成，但是缺乏甲硫氨酸和膽堿[7]。甲硫氨酸和膽堿是重要的甲基供體，肝細胞完整的甲基化能力對于一些重要生理功能的維持十分重要，如脂代謝。因此，MCD誘導小鼠發生NASH可能與肝臟合成甘油三酯(如VLDL)功能損害以及隨之而來的脂質堆積導致肝細胞氧化應激增加有關[8]。該模型的主要優點是MCD喂養第2周小鼠就會發生廣泛的肝臟炎癥，并且在6周后出現明顯的纖維化[9]，比起HFD，MCD誘發的氧化應激、炎癥和纖維化更嚴重，更能模擬臨床病情較重的NASH患者。但是MCD喂養的小鼠會發生明顯的體質量下降，血糖水平下降和胰島素敏感性增加[10]，這與大部分NAFLD患者臨床表現不一致。此為MCD誘導NASH模型的缺點。

(二)膽堿缺乏L-氨基酸飲食(Choline-deficient L-amino acid-defined diet, CDAA)CDAA中，蛋白質由等效的L-氨基酸替代，組成配方為：28.9 kcal/g L-谷氨酸，15.8 kcal/g L-天冬氨酸，12.7 kcal/g L-精氨酸和10.5 kcal/g L-亮氨酸，不包含酒石酸氫膽堿。與人類NASH相比，MCD動物模型缺乏血清脂肪酸的升高，并且出現體質量的下降，CDAA動物模型通過改變飲食組成，提升了和人類NASH病理生理的相關性。與MCD動物模型類似的是，它可以抑制肝細胞的脂肪酸氧化，增加脂質合成，氧化應激和炎癥，最終導致纖維化；區別在于在長時間的CDAA喂養后(大約22周)，小鼠可出現肥胖，胰島素抵抗和血清甘油三酯與膽固醇水平升高[11]。也有報道指出在更長時間的CDAA喂養之后(9個月)，小鼠出現不經歷肝硬化的NAFLD相關肝癌(成瘤率40%)[12]。CDAA喂養小鼠出現代謝相關癥狀的時間長，單獨應用于NASH研究不多。

(三)膽堿缺乏-高脂飲食(Choline-deficient high-fat diet, CD-HFD)CD不同于MCD，其飲食組成中甲硫氨酸無明顯減少，避免了過度的體質量下降，但是大多數CD構建的動物模型仍缺乏明顯的肥胖，也不出現糖耐量的改變和胰島素抵抗。為解決上述問題，學者聯合應用了CD、HFD構建NAFLD相關動物模型，該飲食組成為20%蛋白質，35%碳水化合物和45%脂肪，不添加膽堿。此時，實驗動物能在短時間內(一般為6～12周)發生NASH，同時伴隨血清轉氨酶升高。有學者在一定時間內(12個月)通過CD-HFD喂養，成功在小鼠中誘導出了NAFLD相關的HCC[13]。該模型最大的缺點是纖維化發生緩慢，成瘤周期長(12個月)，并且成瘤率低(25%)。

三、NAFLD相關肝癌模型

單純飲食誘導NAFLD相關HCC動物模型雖有報道[12-14]，但是此類模型的普遍缺點是造模時間長，成瘤率低。因此，在一般實驗研究當中除了運用特殊飲食，還會使用一些特殊小鼠，或者加用某些藥物/毒物以模擬NAFLD相關HCC。

(一)HFD喂養MUP-uPA小鼠 MUP-uPA小鼠是一種能在肝細胞中特異性地大量表達尿激酶纖溶酶原激活物(urokinase plasminogen activator, u-PA)的小鼠(6周齡)，大量的u-PA能夠引起肝細胞內質網應激和肝臟損傷，這兩者都與人類NASH進展相關[15]。Hayato Nakagawa等[16]予以MUP-uPA小鼠(6周齡)HFD喂養，小鼠能在整個觀察期間維持高血清轉氨酶水平，并在24周內誘導出NASH，32周后出現肉眼可見的腫瘤灶，成瘤率85%。該小鼠模型有肝細胞氣球樣變、炎癥浸潤、細胞周圍及橋接纖維化表現，同時伴隨持續的肝細胞死亡和代償性增殖，這很好的模擬了人類NASH的病理生理以及NASH進展成HCC的過程。因此非常適用于NASH相關研究。

(二)PTEN基因敲除小鼠 PTEN被認為是一種抑癌基因，在許多人類腫瘤當中存在突變。肝細胞特異性的PTEN敲除小鼠肝臟發生脂肪樣變，同時伴隨著肝細胞氣球樣變、Mallory小體形成、小葉炎癥和細胞周圍纖維化，在74～78周時，83%的雄性小鼠和50%的雌性小鼠誘導出了NASH相關HCC[17]。該模型因此常用來探索NASH以及相關HCC進展的機制。但是肝細胞特異性PTEN敲除小鼠表現出胰島素高敏感狀態，并且不發生肥胖，這是與人類NASH及相關HCC發生過程中相悖的地方。

(三)鏈脲霉素聯合HFD 鏈脲霉素(streptozotocin, STZ)是一種抗腫瘤藥物，其對胰島β細胞具有毒性作用，可以導致胰島炎癥和損傷，引起胰島素分泌障礙，從而誘發糖尿病。Masato Fujii等[18]對出生2 d的C57BL/6J 雄性小鼠皮下注射200 μg STZ，出生4周后予以HFD喂養，該模型在HFD喂養后第2周即出現肝臟炎癥，氣球樣變及纖維化，在喂養后第16周形成肉眼可見的腫瘤，成瘤率100%。但當利用相同條件處理雌性小鼠時，小鼠僅出現糖尿病癥狀而無腫瘤發生。這是多數小鼠模型中存在的問題，即通常只有雄性小鼠才能誘導出較為理想的NAFLD相關表型。但總體而言，STZ注射聯合HFD喂養的小鼠成瘤時間短，成瘤率高，是實驗研究中常用的NAFLD-HCC動物模型。

(四)四氯化碳聯合CDAA 四氯化碳(Carbon Tetrachloride, CCl4)具有肝毒性，在經肝臟代謝后增加了肝細胞的氧化應激，從而導致脂質和氧化產物的堆積以及強烈的炎癥反應，最終引起肝纖維化。單獨使用CCl4不能引起肥胖，胰島素抵抗，本身并不適用于構建NAFLD相關動物模型。因此常常結合一些特殊飲食。CCl4聯合CDAA是一種常見的用于模擬NAFLD-HCC的形式，CDAA喂養C57BL/6小鼠(6～8周齡)，每周腹腔注射CCl40.2μl/g ，9個月時成瘤率100%。該模型的缺點是造模時間較長，且動物肝臟纖維化程度過重[12]。

(五)二乙基甲硝胺聯合HFD或ob/ob小鼠 二乙基亞硝胺(diethylnitrosamine, DEN)是一種研究常用的致癌制劑，它能夠引起肝細胞氧化應激和DNA突變，增強脂毒性，加速肝臟纖維化和肝硬化進展，廣泛用于構建HCC動物模型。通過結合特殊飲食或者特殊基因型小鼠，就能夠模擬NAFLD基礎上HCC的發生。Eek Joong Park等[19]予以野生型和ob/ob 小鼠(14 d齡)腹腔注射DEN25mg/kg，4周后予以野生型小鼠HFD喂養，ob/ob小鼠低脂飲食，9月后成功誘導出NAFLD相關HCC。

上述模型雖然能很好地幫助我們研究NAFLD相關HCC病理生理，模擬大多數NAFLD患者經歷肝纖維化、肝硬化這一晚期階段再形成HCC的過程[20]，但是人類很少有機會接觸到這些具有致癌作用的藥物或者毒物，并且NAFLD基礎上發生HCC機制復雜，因此上述藥物/毒物基礎是構建的動物模型最大的缺點就是與人類成瘤病因不同。

四、總結與展望

NAFLD現今仍無精準有效的治療手段，因此臨床上迫切的需要在闡明其中發病機制的基礎上，找到和確認新的藥物干預治療靶點。動物模型是一種不可或缺的研究工具。本文總結了目前常用的動物模型，分析了模型各自的優缺點，為學者獲得高質量研究成果提供保障。