石榴皮提取物和鞣花酸對人脂肪干細胞增殖和分化的影響

焦士蓉,唐子堯,孫博瑞,姚 瑤,王 周,陰文婭,馬思思

(1. 西華大學食品與生物工程學院，四川 成都 610039; 2. 東京大學醫學部，日本 東京 113-8655;3.四川大學公共衛生學院，四川 成都 610065)

肥胖已經成為世界性的流行病，可引起腎衰、脂肪肝、高血壓和某些癌癥[1-2]。肥胖的生成，與遺傳、環境及飲食習慣密切相關，特別是高能量飲食是導致肥胖的重要原因。除控制食用高脂飲食外，采用藥物治療肥胖癥也成為了重要手段；但可用于臨床治療的藥物少，且有毒副作用[3]。人脂肪干細胞(human adipose-derived stem cells，hADSCs)，存在于成熟的脂肪組織中，可通過分化、增殖生成脂肪細胞，而脂肪細胞的增加與脂肪組織體積的增大，可形成肥胖[4]；因此研究如何通過抑制脂肪細胞的增殖與分化，維持脂肪組織內脂肪細胞數量的動態平衡，而達到抑制肥胖及相關疾病的目的，顯得尤為重要。Shiwani S等[5]的研究表明，多酚類物質可以抑制脂肪細胞和誘導脂肪細胞凋亡。石榴皮以其高含量的酚醛化合物、鞣花單寧、原花青素、復合多糖、黃酮類化合物等成分，表現出強的抗誘變、抗氧化、抗菌和抗凋亡特性[6-9]。May NAM等[10]的研究表明石榴及提取物對于預防和治療肥胖都有潛在的作用。同時鞣花酸為石榴皮中鞣花單寧的水解產物，研究表明鞣花酸對脂肪細胞有抑制作用[11]。但關于石榴皮及鞣花酸對人脂肪干細胞增殖及分化的影響的研究少有報道。本研究旨在探討石榴皮提取物及鞣花酸對人脂肪干細胞增殖及分化的影響，為預防和治療肥胖，為石榴皮資源的開發提供依據和線索。

1 材料與方法

1.1 實驗主要材料

DMEM/F12(1 ∶1)培養基、青霉素-鏈霉素溶液(美國HYCLONE公司)；胎牛血清(FBS,美國Giboc公司)；Ⅰ型膠原酶、油紅O染色劑、胰蛋白酶、醫用地塞米松注射劑(Dex)、人類重組胰島素、吲哚美辛、3-異丁基-1-甲基黃嘌呤(IBMX)、3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽(MTT)、二甲基亞砜(DMSO)均購自美國Sigma公司， 鞣花酸(MUST14031010，≧98%(成都曼思特生物科技有限公司)；其余試劑均為分析純試劑。

1.2 石榴皮提取物的制備

石榴皮購買自成都中藥飲品有限公司。石榴皮的提取物方法及成分測定參考文獻[12]的方法

1．3 實驗方法

1.3.1 原代人脂肪干細胞的分離與培養[13-14]

通過經患者同意的乳腺切除手術獲得健康乳腺脂肪組織， 500 U·mL-1雙抗的PBS，無菌條件下漂洗3遍，剪碎成1.0 mm3的組織塊，加入0.1%Ⅰ型膠原酶，120 r·min-1，37 ℃消化60 min，加入DMEM/ F12培養液終止消化，1 200 r·min-1離心5 min，取下層脂肪干細胞和紅細胞等混合細胞的沉淀，加入完全培養基重懸細胞沉淀，200目過濾，以1×104～5×104個·cm-2接種至培養瓶中，于37 ℃，5%CO2培養箱孵育48 h后換液，以后每3 d換液1次。原代培養生長融合達到90%，采用0.25%胰酶消化后，1 ∶3傳代接種到新的培養瓶中持續體外擴增培養，采用P3-P7代細胞進行實驗。

1.3.2 石榴皮提取物、鞣花酸對hADSCS增殖的抑制作用[13]

采用96孔板，每孔加入200 μL的完全培養液，稀釋密度為5×104個cells·mL-1hADSCs，37 ℃，5%CO2的條件孵育至細胞完全融合，棄去上清液。每孔加入200 μL分別含有25、5、1 μg·mL-1的石榴皮提取物；1.5、3.0、4.5 μg·mL-1鞣花酸的成脂誘導培養液(DMEM/F12，10%FBS，100 U·mL-1青霉素-鏈霉素溶液，1 μmol·L-1Dex，5 μmol·mL-1人醫用胰島素，0.2 mmol·L-1吲哚美辛，0.5 mmol·L-1IBMX),同時設誘導培養液+DMSO 0.1%為對照組，完全培養液+DMSO 0.1%為空白組，每組6個復孔。每3 d換一次液，經14 d誘導分化后，用MTT法測定，540 nm波長下測定其吸光度A值，分別計算不同濃度石榴皮提取物(PoPE) 和鞣花酸(EA)對融合期hADSCS增殖的相對抑制率，公式如下：

相對抑制率=[(A1-A0)-

(A2-A0)]/ (A1-A0)×100%

式中:A0為空白孔的吸光度平均值；A1為對照組的吸光度的平均值；A2為各干預組的吸光度平均值。

1.3.3 石榴皮提取物、鞣花酸對hADSCS分化的抑制作用[13]

采用油紅O染色法, 觀察石榴皮提取物及鞣花酸對hADSCS分化能力的影響。采用24孔板，每孔加入1 mL培養液，細胞接種密度為1×105個·孔-1，37 ℃，5%CO2孵育培養至細胞完全融合，棄去上清液。每孔分別加入含有25、5、1 μg·mL-1的PoPE和4.5、3、1.5 μg·mL-1EA的成脂誘導培養液, 進行誘導分化，并設置對照組(誘導培養液+DMSO 0.1%)、空白組(完全培養液+DMSO 0.1%)，每組設置3個復孔。每3 d換一次液，經14 d的誘導分化，倒置顯微鏡下觀察其形態學變化，用油紅O染色法測定甘油三酯的相對含量，490 nm波長下測定其吸光度A值。公式如下：

相對抑制率=[(A1-A0)-(A2-

A0)]/ (A1-A0)× 100%

式中:A0為空白孔的吸光度平均值；A1為對照組的吸光度的平均值；A2為各干預組的吸光度平均值。

2 統計學方法

3 實驗結果與分析

3.1 石榴皮提取物及鞣花酸對人脂肪干細胞增殖的抑制情況

如圖1所示，與對照組相比較，石榴皮提取物質量濃度為25、5、1 μg·mL-1時，其對hADSCs的抑制率分別為31.87%、15.18%、13.99%，中、低濃度間沒有顯著性差異，與高濃度間有顯著性差異(P<0.05)。鞣花酸質量濃度為4.5、3.0、1.0 μg·mL-1時，其對hADSCs的抑制率分別為47.23%、23.59%、15.77%(P<0.05)。

由圖1可知，石榴皮提取物及鞣花酸對hADSCs的增殖均有抑制作用，且成劑量效應關系，另鞣花酸的抑制濃度顯著低于石榴皮提取物，也說明鞣花酸為有效活性物質。

圖1 石榴皮提取物和鞣花酸對人脂肪干細胞增殖的抑制作用

3.2 石榴皮提取物、鞣花酸對hADSCs分化的抑制情況

加入誘導劑的第二到第三天，脂肪細胞中開始出現細小脂滴，隨著時間增加，脂滴呈串珠或戒環狀不斷增大。誘導14 d以后，形成成熟脂肪細胞，脂滴變圓且形狀飽滿，經油紅O染色后，脂滴呈紅色，如圖2、圖3所示。

(從左至右：空白、對照、1、5、25 μg/mL)

(從左至右：空白、對照、1.5、3、4.5 μg·mL-1)

從圖2、3中空白與對照及PoPE和EA組可以看出，正常梭形細胞形態發生改變，變為類圓形或多邊形，細胞內積累脂滴，經油紅O染色，PoPE和EA處理組脂肪粒的數量與對照相比，脂滴的數量和面積明顯減少，并隨著處理組濃度的增加，對脂滴形成的抑制作用顯著增加。

如圖4所示，石榴皮提取物為25、5、1 μg·mL-1時，與正常誘導對照組相比，其對hADSCs分化能力的抑制率分別為45.88%、24.30%、21.24%，中、低間沒有差異，與高濃度具有顯著性差異(P<0.05)。與正常誘導對照組相比，鞣花酸4.5、3.0、1.5 μg·mL-1時，其抑制率分別為44.96%、34.88%、28.23%(P<0.05)。

圖4 石榴皮提取物和鞣花酸對人脂肪干細胞分化的抑制作用

4 結論

肥胖已經成了世界性的健康問題, 肥胖是由于個體能量的吸收大于消耗而引起的。從細胞水平考慮, 是由于單個脂肪細胞體積增大或脂肪細胞的數目增多而引起的。本研究表明, 在一定劑量范圍內, 石榴皮提取物與鞣花酸能夠劑量依賴性地抑制hADSCs的增殖與分化，減少脂肪細胞內甘油三酯的累積，可望開發為減肥降脂的純天然藥物。