中華蜜蜂Apidaecin的重組表達及其抗菌活性

陳文鳳，王紅芳，劉振國，張衛星，郗學鵬，胥保華

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中華蜜蜂Apidaecin的重組表達及其抗菌活性

陳文鳳，王紅芳，劉振國，張衛星，郗學鵬，胥保華

（山東農業大學動物科技學院，山東泰安 271018）

【目的】研究中華蜜蜂（）抗菌肽Apidaecin在枯草芽孢桿菌（）中的重組表達，并驗證純化后的重組抗菌肽Apidaecin在體內和體外是否具有抗菌活性，為開發新型、安全具有抗菌和免疫調節功能的抗菌肽制劑提供理論依據。【方法】以意大利蜜蜂（）Apidaecin為模板，克隆出中華蜜蜂抗菌肽Apidaecin，成功構建his-pHT43/Apidaecin表達載體，并參照MoBiTec所提供的制備方法成功制得枯草芽孢桿菌感受態細胞，現配現用，以保證其活性并得以在枯草芽孢桿菌表達系統中重組表達。使用His標簽蛋白純化試劑盒（可溶性蛋白）進行表達蛋白的分離純化，使用Easy II Protein Quantitative Kit（BCA）試劑盒測定濃度。純化得到的重組抗菌肽Apidaecin作用于大腸桿菌K88，在體外進行抑菌圈試驗和最小濃度抑菌法測定；在體內，以小鼠為試驗動物模型，試驗組小鼠腹腔注射重組抗菌肽Apidaecin，陰性對照組注射相同體積的生理鹽水，陽性對照組注射相同體積的頭孢霉素，然后人為感染大腸桿菌K88，感染24 h后對小鼠進行解剖，取得腸道樣品和血液樣品，并從腸道屏障和免疫功能兩個方面探討重組抗菌肽Apidaecin對感染大腸桿菌K88小鼠的保護作用。使用ELISA試劑盒對染菌小鼠血清免疫球蛋白（IgA、IgG、IgM）與腸道sIgA水平進行測定，采用qRT-PCR法對小鼠腸道緊密連接蛋白基因（claudin-1、ZO-2）以及小鼠腸道細胞因子（促炎因子TNF-、IFN-、IL6和抑炎因子IL10）的轉錄水平進行測定。【結果】克隆得到的中華蜜蜂含有183 bp的堿基，編碼60個氨基酸，包含Apidaecin的信號肽序列、一個基礎的RR二肽以及抗菌肽Apidaecin的氨基酸序列（內含高度保守的8個氨基酸序列），編碼的蛋白質命名為AccApidaecin，其分子量為15.6 kD，等電點為5.33。在IPTG終濃度為3 mmol·L-1，誘導溫度為30℃，誘導表達12 h后，可從1 L表達上清中純化得到約20 mg抗菌肽。藥敏試驗顯示，重組抗菌肽Apidaecin在體外與陰性對照相比有明顯抑菌圈出現，且測得的最小抑菌濃度為10 mg·L-1；在小鼠體內，腹腔注射重組抗菌肽Apidaecin的染菌試驗組與注射生理鹽水的染菌試驗組相比免疫球蛋白含量差異顯著(＜0.05)，說明腹腔注射重組抗菌肽Apidaecin能夠有效緩解由大腸桿菌K88引起的小鼠免疫球蛋白含量的增加；同時，小鼠腸道相關蛋白的基因表達量也差異顯著(＜0.05)，說明重組抗菌肽Apidaecin能夠有效保護被大腸桿菌K88侵染的小鼠腸道。【結論】在枯草芽孢桿菌中能夠成功重組表達中華蜜蜂抗菌肽Apidaecin，并且純化后的中華蜜蜂抗菌肽Apidaecin在體外對大腸桿菌K88有良好的抗菌效果；經腹腔注射進入小鼠體內，能夠提高小鼠的免疫機能，有效抵抗大腸桿菌K88對小鼠的侵染。

中華蜜蜂；抗菌肽；重組表達；大腸桿菌；抗菌活性

0 引言

【研究意義】抗生素對于人類的健康和社會的發展具有重要作用，但目前抗生素濫用現象已引起國內外的密切關注，并且抗菌藥物的耐藥性已被視為全球最危害公眾健康的問題之一。為了應對耐藥性菌株感染，研究者一方面在對傳統抗生素進行結構改造降低病原菌耐藥性，提高藥物療效，另一方面也在不斷研究和開發新型抗菌藥物。自第一個昆蟲源的抗菌肽報道以來，抗菌肽作為一種潛在的替代藥物立即引起了人們的高度關注。蜜蜂是各種作物的有效傳粉者，對農業和生態環境中都具有至關重要的作用，同時蜜蜂也經常暴露于各種病原體的脅迫環境中。在長期與外來病原物作斗爭的過程中，蜜蜂形成了與之相對應的分子進化策略，發展出反應靈敏且高表達的Apidaecin抗菌肽基因家族以及其他抗菌肽家族，由于其具有天然的抗菌活性，有望成為抗生素的替代品。從天然組織中分離抗菌肽工作量大，難度高，且獲得的量很少；化學合成雖然能提供大量的抗菌肽，但價格昂貴，無法滿足研究和潛在應用的需求。隨著現代基因工程技術的不斷發展，使大規模生產抗菌肽并降低生產成本具備了可行性，因此探索適合的基因表達系統表達出大量具有活性的抗菌肽具有重要意義。【前人研究進展】在過去幾十年的研究中，人們對大腸桿菌（）系統的遺傳學、生物化學和分子生物學方面有了充分的認識，使之成為許多外源蛋白的首選表達系統。大腸桿菌遺傳圖譜明確，易培養、周期短、費用低[1]，對許多蛋白質有較強的耐受能力，能較高水平地表達多種蛋白[2]，所以成為應用于DNA重組技術的主要宿主細菌。然而抗菌肽的抗菌特性使得它們對宿主菌具有潛在的致命毒性，這成為抗菌肽在大腸桿菌中重組表達面臨的巨大挑戰。酵母具有比大腸桿菌更完備的基因表達調控機制和對表達產物的加工修飾和分泌能力，并且不會產生內毒素，是基因工程中良好的真核基因受體菌[3]，但發酵周期相對較長。枯草芽孢桿菌（）屬于芽孢桿菌屬，是一類好氧型、內生抗逆性孢子的革蘭氏陽性菌。對于飼用抗菌制劑的開發，枯草芽孢桿菌表達系統擁有獨特的優點。與大腸桿菌表達系統相比較，枯草芽孢桿菌細胞壁不含內毒素，是被公認的安全微生物，可直接添加于飼料中；與酵母表達系統相比較，枯草芽孢桿菌發酵周期短，操作簡單，沒有明顯的密碼子偏好性；枯草芽孢桿菌對培養基的要求遠低于酵母，生產成本低[4-6]。此外，枯草芽孢桿菌是豬等動物腸道中的一種益生菌，對維持動物腸道健康具有重要作用。同時蛋白酶缺陷型菌株的構建提高了目的蛋白的表達水平，新型載體的設計提高了質粒的穩定性等[7]。因此，枯草芽孢桿菌表達系統適于大多數飼用抗菌肽的重組表達。蜜蜂抗菌肽是蜜蜂在受到病原物感染后，其脂肪體迅速合成的一些具有抗菌活性的肽類，然后釋放到血淋巴中發揮抑制細菌、真菌、病毒的作用[8]。蜜蜂抗菌肽屬于先天免疫，在體液內有4個基因家族：Apidaecin[9]、Abaecin[10]、Hymenoptaecin[11]、Defensin[12]。其中，Apidaecin是蜜蜂體液中最早被研究的一種抗菌肽，主要對革蘭氏陰性菌起作用。另外，獨特的前體結構使受到極少量的病原物刺激后即迅速表達[9]。并且自然界中的野生中華蜜蜂（）種群由于一直受到相對較強的環境選擇壓力，從而保持了中華蜜蜂原有的抗菌肽基因的多樣性，長期的家養馴化使得意大利蜜蜂（）抗菌肽基因退化。【本研究切入點】抗菌肽作為昆蟲體液免疫系統的重要成分，為昆蟲抵御病原物的侵襲建立了堅固的屏障。但目前有關蜜蜂抗菌肽的研究報道幾乎都集中于意大利蜜蜂，中華蜜蜂的相關報道很少，其中對于中華蜜蜂重組抗菌肽抗菌活性的研究更少。【擬解決的關鍵問題】通過基因工程技術，利用枯草芽孢桿菌表達系統表達中華蜜蜂抗菌肽Apidaecin，并對其進行體內和體外抗菌活性的驗證，為開發新型、安全具有抗菌和免疫調節功能的抗菌肽制劑提供理論依據。

1 材料與方法

試驗于2016—2017年在山東農業大學動物科技學院完成。

1.1 材料

供試昆蟲：中華蜜蜂取自山東農業大學試驗蜂群。供試小鼠為屏障環境SPF級KM小鼠。

主要試劑：總RNA提取試劑盒（Trizol）、大腸桿菌感受態DH5購自北京全式金公司；原核表達載體Pet-30a(+)由筆者實驗室提供；DNA分子質量標準（DNA marker DL2000）、M-MLV反轉錄酶及SYBR Green Ⅱ定量試劑均購自日本Takara公司；異丙基硫代半乳糖苷（IPTG）、dNTP、LA-Taq DNA聚合酶及凝膠回收試劑盒均購自美國PUEX公司；枯草芽孢桿菌WB800N以及枯草芽孢桿菌表達載體his-pHT43購自于淼靈質粒平臺（http://www.miaolingbio.com/）；血清免疫球蛋白試劑盒以及腸道分泌型免疫球蛋白IgA試劑盒購自于科諾迪生物；His標簽蛋白純化試劑盒（可溶性蛋白）購自于康為世紀生物科技有限公司；Easy II Protein Quantitative Kit （BCA）試劑盒購自北京全式金公司。

1.2 方法

1.2.1 總RNA提取及cDNA的合成 Trizol法提取蜜蜂以及小鼠腸道樣品的總RNA，紫外分光光度計測定總RNA濃度和純度。用反轉錄試劑盒對總RNA進行反轉錄，反轉錄反應條件：體系混勻后，42℃反應40 min，75℃滅活5 min。反轉錄產物保存于-20℃。

1.2.2 中華蜜蜂引物設計、PCR擴增、克隆、測序以及誘導表達 引物設計：由于中華蜜蜂和意大利蜜蜂為兩個親緣關系最近的物種，同一基因的序列在這兩個物種間變異很小，因此，根據GenBank中意大利蜜蜂基因序列（GenBank登錄號LOC406115），利用Primer 5.0軟件，設計基因序列引物，引物序列見表1，引物由上海生工生物工程技術有限公司（簡稱上海生工）合成。

在PCR擴增中，反應體系（25 μL）：5 μL cDNA、2.5 μL 10×PCR緩沖液、1 μL dNTP、1 μL模板，上下游引物各1 μL、0.25 μL LA-Taq DNA聚合酶，18.25 μL雙蒸水。擴增程序：94℃預變性4 min；94℃變性40 s，50℃退火30 s，72℃延伸30 s，35個循環；72℃延伸10 min；4℃保存待測。將PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳并割膠純化，克隆于T1載體內，最后將鑒定的陽性克隆菌送至上海生工進行測序。

表1 基因引物序列

根據測序結果和比對結果，選擇比對后的特異性序列，然后將含特異性序列的菌液送至上海生工并由其克隆至載體pHT43。

1.2.3 菌株轉化、蛋白誘導表達純化以及蛋白濃度測定 枯草芽孢桿菌感受態細胞的制備和轉化以及誘導表達參見MoBiTec所提供的制備方法（https://www. mobitec.com/cms/products/bio/04_vector_sys/bacillus_subtilis_expression.html），獲得的枯草芽孢桿菌感受態細胞應立即使用，以保證最高的轉化效率。在IPTG終濃度為3 mmol·L-1，誘導溫度為30℃，誘導表達12 h后進行分離純化。收集菌體，超聲破碎，4℃，12 000 r/min離心15 min，收集上清，按His標簽蛋白純化試劑盒（可溶性蛋白）操作說明書進行蛋白的純化，并使用BCA蛋白定量方法測定純化后的蛋白濃度。

1.2.4 實時熒光定量PCR（qRT-PCR） 取1 μL cDNA加入到20 μL熒光定量體系中，按照熒光定量試劑盒（TaKaRa）操作指南，用7500 real-time PCR儀（ABI 7500，USA）檢測目的基因相對表達量。反應程序：預變性95℃，10 s；變性95℃，5 s；退火60℃40 s，40個循環，熔解曲線添加，1個循環。目的基因引物設計參考序列來自于NCBI數據庫，以為內參，采用Primer 5.0進行引物設計，委托上海生工合成引物，引物序列如表1所示。

1.2.5 小鼠分組與處理 18—20 g體重的雄性小鼠60只，隨機分成6組，每組10只，購自濟南朋悅實驗動物繁育有限公司；小鼠日糧為小鼠SPF級大小鼠維持飼料，購自華阜康生物有限公司；飼養環境：屏障系統，溫度控制在22—25℃，相對濕度40%—60%，黑暗12 h，光照12 h。6組不同處理參考小鼠試驗分組（表2），接菌后，取腸道相關樣品進行試驗。

1.2.6 抑菌圈檢測重組抗菌肽的抗菌活性 環劃線接種大腸桿菌于瓊脂平板，37℃生化培養箱過夜培養至長出單菌落。挑取單菌落接種于5 mL新鮮肉湯培養基中，于37℃搖床中恒溫振蕩培養過夜；將上述過夜培養菌懸液50 μL轉接至5 mL新鮮肉湯培養基中，于37℃恒溫振蕩培養2—3 h至吸光值OD600=0.5左右。取100 μL菌懸液均勻涂布于固體培養基上，將紙片輕輕放置于涂布好菌液的培養基上，滴加3—4 μL相應的液體，設置陰性（滅菌水）和陽性（頭孢霉素）對照，按照同樣的方法和步驟，設置4個重復的固體培養基，倒置于37℃恒溫培養箱中過夜，觀察并拍照記錄結果。

表2 重組抗菌肽Apidaecin對小鼠感染大腸桿菌K88保護作用試驗分組

菌懸液指OD600=0.5的大腸桿菌K88[13]菌懸液The bacteria suspension refers to theK88 suspension of OD600=0.5

1.2.7 最小抑菌濃度法（MIC）檢測重組抗菌肽的抗菌活性 將同1.2.6方法培養的OD600=0.5的菌懸液10 μL轉接至10 mL新鮮肉湯培養基中，渦旋振蕩混勻；此時細菌密度在1×105cfu/mL，用于MIC的測定。將抗菌肽與抗生素進行梯度稀釋，至終濃度為2 560、1 280、640、320、160、40、20、10、5和2.5 μg·mL-1系列濃度稀釋液；向無菌96孔圓底板中加入90 μL制備好的菌懸液，再逐一加入10 μL相應濃度的抗菌肽稀釋液或抗生素稀釋液，待測終濃度分別為256、128、64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25 μg·mL-1；設菌懸液為陽性對照孔，肉湯培養基為陰性對照，重組抗菌肽和抗生素（頭孢菌素）均設3次重復，將96孔板置于37℃生化培養箱中保濕靜置培養18—24 h，培養后觀察各孔底部是否有細菌沉淀產生，無肉眼可見細菌沉淀的最小濃度可判定為該抗菌物質的MIC。

1.3 數據分析

數據采用SAS 9.2軟件進行單因素方差分析（one- way ANOVA）和Turkey檢驗進行比較分析，結果表示為平均值±標準差。＜0.05表示差異顯著。

2 結果

2.1 中華蜜蜂Apidaecin cDNA的克隆以及序列分析

以中華蜜蜂總RNA反轉錄的cDNA為模板，利用引物API-F/ API-R進行PCR擴增，獲得一條183 bp特異性片段（圖1），通過ExPASy網站（http://www. expasy.cn）進行分析獲得中華蜜蜂，含有183 bp的堿基，編碼60個氨基酸，編碼蛋白質命名為AccApidaecin，其分子量為15.6 kD，等電點為5.33。其氨基酸序列分析如圖2所示。

M：DL 2000 DNA Marker；1—4：基因擴增產物Product of genome walking

2.2 AccApidaecin蛋白的純化與分離

在枯草芽孢桿菌中重組表達了具有活性的AccApidaecin。在IPTG終濃度為3 mmol·L-1，誘導溫度為30℃，誘導表達12 h后進行分離純化。抗菌肽主要分布在胞外，分泌效率高。通過His標簽蛋白純化試劑盒（可溶性蛋白）從1 L表達上清中純化得到了約20 mg抗菌肽，圖3為SDS-PAGE電泳結果。

2.3 抑菌圈檢測重組抗菌肽的抗菌活性

將OD600=0.5的K88均勻涂布于固體培養基上，5個0.5 cm的紙片上分別滴加3 μL的滅菌雙蒸水、10 mg·L-1重組AccApidaecin、20 mg·L-1的重組AccApidaecin、10 mg·L-1的頭孢霉素和100 mg·L-1的頭孢霉素，涂好的培養基放于37℃培養箱中培養12 h。結果如圖4所示，與陰性對照1號相比，其余均有明顯抑菌圈出現，表明重組抗菌肽在體外具有良好的抗菌活性。

方框表示AccApidaecin的信號肽序列；下劃線部分為一個基礎的RR二肽；橢圓形邊框表示抗菌肽AccApidaecin氨基酸序列，陰影部分為高度保守的8個氨基酸序列The box indicates signal peptide sequence of AccApidaecin; The underlined part represents a basic RR dipeptide; The oval border represents the amino acid sequence of AccApidaecin, and the shaded part is a highly conservative sequence of 8 amino acids

1：蛋白Marker protein marker；2：誘導表達的pHT43空載體induced overexpression of pHT43；3：未誘導表達的pHT43(+)-AccApidaecin non-induced overexpression of pHT43(+)-AccApidaecin；4—8：誘導表達的pHT43(+)-AccApidaecin Induced overexpression of pHT43(+)- AccApidaecin

2.4 最小濃度抑菌法檢測重組抗菌肽的抗菌活性

重組抗菌肽AccApidaecin對K88的最小抑菌濃度為10 mg·L-1，頭孢噻肟（Cafotaxime Na salt）對K88的最小抑菌濃度為5 mg·L-1。

2.5 重組抗菌肽對染菌小鼠血清免疫球蛋白含量與腸道sIgA水平的影響

如圖5所示，染菌對照組免疫球蛋白含量與腸道sIgA水平最高，并與其他各組差異顯著。血清IgA、IgG和IgM水平變化與sIgA—致，表明重組抗菌肽AccApidaecin顯著緩解由于染菌導致的血清和腸道免疫球蛋白含量的升高。

1：滅菌雙蒸水Sterilized double distilled water；2：100 mg·L-1的頭孢霉素Cafotaxime (100 mg·L-1)；3：20 mg·L-1的重組Apidaecin recombinant Apidaecin (20 mg·L-1)；4：10 mg·L-1的頭孢噻肟Cafotaxime (10 mg·L-1)；5：10 mg·L-1重組AccApidaecin Recombinant AccApidaecin (10 mg·L-1)

2.6 重組抗菌肽對染菌小鼠腸道相關蛋白基因表達的影響

采用qRT-PCR法對小鼠腸道緊密連接蛋白基因（claudin-1、ZO-2）以及小鼠腸道細胞因子（促炎因子TNF-、IFN-、IL6和抑炎因子IL10）的表達水平進行了測定，結果表明染菌后TNF-、IL6和IL10表達水平顯著升高（＜0.05），而claudin-1、ZO-2和IFN-表達水平顯著降低（＜0.05）（圖6-a、6-b）；然而染菌后，注射了重組抗菌肽和頭孢霉素的試驗組，都顯著抑制TNF-、IL6和IL10表達水平的升高以及claudin-1、ZO-2和IFN-表達水平的降低（＜0.05）（圖6-c、6-d、6-e、6-f）。綜合來看，重組抗菌肽Apidaecin能夠有效保護大腸桿菌K88侵染后的小鼠腸道。

NC：正常對照組Normal control group；API：20 mg·L-1重組Apidaecin染菌組20 mg·L-1 Recombinant Apidaecin infection group；K88：染菌對照組Infection control group；CTX：150 mg·L-1頭孢噻肟染菌組150 mg·L-1Cefotaxime infection group。圖6同The same as Fig. 6

3 討論

Casteels-Josson等[14]分析發現一個Apidaecin前體蛋白可加工生產最多可達12個Apidaecin的單元，即有重復單元的現象，導致的直接結果是可以迅速地增強昆蟲本身的免疫應答，產生超量的蜜蜂肽。具有生物活性的Apidaecin是由兩個加工序列EAEPEAEP（變異體）和RR連接在一起的。如圖2所示，對克隆得到的序列進行分析，GNNRPVYIPQPRPPHPRI是Apidaecin的18個氨基酸序列，Apidaecin是富含脯氨酸的短肽，在C端具有高度保守的8個氨基酸（PRPPHPRL/I），而它們的N-末端是可變區，與其抗菌活性息息相關。目前，抗菌肽已在很多表達系統運用各種表達策略成功表達，例如大腸桿菌中的融合表達[15-17]和雜合表達[18-20]、畢赤酵母菌表達系統[21]、乳酸乳球菌表達系統[22]等，但對于重組抗菌肽的抗菌活性并沒有進一步的研究與驗證。

Apidaecin對革蘭氏陰性菌效果顯著，與細菌表面結合，然后轉運到細胞質中，最后與靶蛋白結合（主要是熱休克蛋白DnaK）。由于這種靶向特異性，Apidaecin對哺乳動物細胞是無毒的和非溶血的，因此被認為是新的抗生素候選藥物[23]。本研究以大腸桿菌K88作為致病原對重組抗菌肽體外抗菌活性以及小鼠的體內抗菌活性進行驗證，抑菌圈試驗結果表明重組抗菌肽Apidaecin在體外具有良好的抗菌活性，重組抗菌肽Apidaecin對大腸桿菌K88的最小抑菌濃度為10 mg·L-1。

圖6 重組抗菌肽對染菌小鼠腸道相關蛋白基因表達的影響

重組抗菌肽Apidaecin在體外具有良好的抗菌活性，但體內環境遠比體外環境復雜。體內pH、離子強度以及宿主的蛋白酶等都會對抗菌肽造成影響。因此，本試驗在獲得重組抗菌肽的基礎上，以小鼠為試驗動物模型，從腸道屏障和免疫功能兩個方面探討重組抗菌肽Apidaecin對感染大腸桿菌K88小鼠的保護作用。緊密連接是腸黏膜機械屏障的重要組成部分，主要由跨膜蛋白和胞質蛋白組成，其中跨膜蛋白包括occludin、claudin-1、連接黏附分子等；胞質蛋白主要為ZO家族，與緊密連接結構的其他蛋白以及細胞骨架相連。緊密連接具有物質大小和電荷選擇性，是決定腸道通透性的關鍵因素，維持緊密連接形態和功能的完整性對保護腸黏膜屏障、防止細菌移位有著重要意義[24]。小鼠腸道細胞因子（促炎因子和抑炎因子）平衡失調被認為是腸道炎癥性疾病的一個重要發病機制，細胞因子異常表達與結腸炎的發生和發展密切相關[25]。本試驗采用qRT-PCR法對小鼠腸道緊密連接蛋白基因（claudin-1、ZO-2）以及小鼠腸道細胞因子（促炎因子TNF-、IFN-、IL6和抑炎因子IL10）的表達水平進行了測定，結果發現大腸桿菌K88侵染小鼠后，導致claudin-1、ZO-2和IFN-表達水平顯著低于正常對照組，而TNF-、IL6和IL10表達水平顯著升高，與齊珂珂等[26]的研究相一致。而腹腔注射重組抗菌肽Apidaecin以及頭孢霉素皆可以有效抵御大腸桿菌K88侵染小鼠帶來的一系列炎癥反應，表明重組抗菌肽Apidaecin 能夠有效保護大腸桿菌K88侵染后的小鼠腸道。

本試驗還檢測了血清中免疫球蛋白（IgA、IgG、IgM）以及腸道中sIgA的含量，結果顯示染菌組顯著高于正常對照組，與之前余樹培[27]報道的大腸桿菌K88可導致小鼠腹瀉相符，表明大腸桿菌K88可導致小鼠染病并激起機體的免疫應答。空載體正常組與染菌組相比差異不明顯，而重組抗菌肽Apidaecin以及頭孢霉素的正常組與染菌組相比差異顯著，這幾種免疫球蛋白或細胞因子的水平在一定程度上反應了免疫功能[27-29]，表明腹腔注射的重組抗菌肽Apidaecin能提高小鼠的免疫機能，從而抵抗大腸桿菌K88對小鼠的侵染。

目前，關于抗菌肽的抗菌機制有眾多的猜想，但是抗菌肽抗菌機制研究只針對了個別幾種，所以還沒有一個能夠涵蓋所有種類抗菌肽作用機理的假說，而且也不確定哪種假說更接近真實情況[30]。常見的抗菌肽作用機制有桶板模型[31]、毯式模型[32]、環形孔模型[33]、凝聚模型以及其他作用機制[34]。對于重組抗菌肽Apidaecin的抗菌機制，還需要進一步深入研究。

4 結論

在枯草芽孢桿菌中成功重組表達得到了中華蜜蜂抗菌肽Apidaecin，其在體內/體外均對大腸桿菌K88有良好的抗菌效果，并且能夠提高小鼠的免疫機能，抵抗大腸桿菌K88對小鼠的侵染。

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（責任編輯 岳梅）

Recombinant expression and antimicrobial activity of Apidaecin in

CHEN WenFeng, WANG HongFang, LIU ZhenGuo, ZHANG WeiXing, CHI XuePeng, XU BaoHua

(College of Animal Science and Technology, Shandong Agricultural University, Taian 271018, Shandong)

【Objective】In order to study the recombinant expression of antimicrobial peptide apidaecin ofin, verify whether the purified recombinant antimicrobial peptide Apidaecin has antibacterial activityandor not, and to provide a theoretical basis for the development of new antimicrobial peptide preparations with safe antibacterial and immunomodulatory functions.【Method】The experiment usedApidaecin inas templates to clone the antimicrobial peptide Apidaecin in, and his-pHT43/Apidaecin expression vector was successfully constructed. In addition, the competentcells were successfully prepared according to the method provided by MoBiTec. The cells were prepared and used on demand to ensure the activity. Protein was isolated and purified using 6×His-Tagged Protein Purification Kit (soluble protein), and the Easy II Protein Quantitative Kit (BCA) was used for concentration determination. The purified recombinant antimicrobial peptide Apidaecin acted onK88. The disk diffusion test and minimum inhibitory concentration (MIC) were conducted., mice were used as experimental animal models, mice in the experimental group were injected with recombinant antibacterial peptide Apidaecin by intraperitoneal injection, mice in the negative control group were injected with normal saline of the same volume, and the positive control group was injected with the same volume of cefotaxime, then artificially infected withK88. After 24 hours of infection, the mice were dissected, intestinal samples and blood samples were obtained, and the protective effect of Apidaecin on the mice infected withK88 was discussed from the perspective of intestinal barrier and immune function. Serum immunoglobulin (IgA, IgG, IgM) and intestinal sIgA levels were determined by using ELISA kit in the experiment. In addition, the expression levels of intestinal tightly-connected protein genes (claudin-1, ZO-2) and intestinal cytokines (proinflammatory cytokines TNF-, IFN-, IL6 and anti-inflammatory factor IL10) were determined by qRT-pcr. 【Result】Theinwas cloned, containing 183 bp, encoding 60 amino acids, including signal peptide sequence of Apidaecin, a basic RR dipeptide and amino acid sequence of Apidaecin (containing 8 highly conserved amino acid sequences). The protein encoded is named AccApidaecin, its molecular weight is 15.6 kD and isoelectric point is 5.33. About 20 mg antimicrobial peptides could be purified from 1 L supernatant at the concentration of IPTG was 3 mmol·L-1, induction temperature was 30℃, and inducing time was 12 h. The recombinant antibacterial peptide Apidaecin showed obvious antibacterial ringcompared with the negative control, and the measured MIC was 10 mg·L-1. In mice, there were significant differences in immunoglobulin between the bacterial test group injected with recombinant antimicrobial peptide apidaecin by intraperitoneal injection and the bacterial test group injected with saline (＜0.05), which indicated that recombinant Apidaecin could effectively alleviate the increase of immunoglobulin content in mice caused byK88. The gene expression level of intestinal related proteins in mice was also significantly different (＜0.05), which indicated that the recombinant Apidaecin could effectively protect the intestinal tract of mice infected withK88.【Conclusion】The antimicrobial peptide apidaecin inwas successfully expressed in. The purified antibacterial peptide apidaecin inhas a good antibacterial effect onK88. In addition, it can be injected into mice through abdominal cavity to improve the immune function of mice and effectively resist the infection ofK88 to mice.

; antimicrobial peptide; recombinant expression;; antimicrobial activity

10.3864/j.issn.0578-1752.2019.04.016

2018-09-04；

2018-10-09

國家蜂產業技術體系建設專項（CARS-44）、國家自然科學基金（31572470）、山東省農業良種工程（南種北繁）（2017LZN006）

陳文鳳，E-mail：269099781@qq.com。通信作者胥保華，E-mail：bhxu@sdau.edu.cn