MT和FGF5調控遼寧絨山羊絨毛生長相關LncRNA的篩選及鑒定

金梅，張麗娟，曹倩，郭鑫英

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MT和FGF5調控遼寧絨山羊絨毛生長相關LncRNA的篩選及鑒定

金梅，張麗娟，曹倩，郭鑫英

（遼寧師范大學生命科學學院/遼寧省生物技術與分子藥物研發重點實驗室，遼寧大連 116029）

【目的】篩選出遼寧絨山羊皮膚成纖維細胞中與絨毛生長相關的LncRNA，為絨毛生長相關LncRNA的功能及機制研究提供基礎性數據。【方法】提取MT和FGF5處理的遼寧絨山羊皮膚成纖維細胞總RNA，通過樣品總RNA電泳檢測、測序數據質量評估、Mapping比對、樣品間相關性檢查對提取的總RNA進行質量檢測。篩選出差異表達的LncRNA并預測其靶基因，通過GO和KEGG富集分析，篩選出與絨毛生長相關的LncRNA，并通過Real-time PCR對目標LncRNA進行表達驗證。【結果】（1）樣品總RNA質量檢測結果顯示：RNA 完整性良好、GC含量相對較高，序列較穩定、樣品間表達水平相關性均較高、符合測序要求。（2）差異表達LncRNA的篩選結果顯示：1.0g?L-124h組差異表達LncRNA有32個，其中4個表達上調，28個表達下調；0.2g?L-124h組差異表達LncRNA 有10個，其中4個表達上調，6個表達下調；0.2g?L-172h組差異表達LncRNA有113個，其中5個表達上調，108個表達下調。10-4g?L-124 h組差異表達LncRNA有164個，其中有70個上調，94個下調；10-4g?L-172 h差異表達LncRNA 有189個，其中有78個上調，111個下調；10-6g?L-124 h組差異表達的LncRNA有123個，其中有27個上調，96個下調 。（3） 靶基因GO富集分析結果顯示：1.0g?L-124h組差異表達LncRNA靶基因富集在GO的negative regulation of transcription from RNA polymerase II promoter；0.2g?L-124h組無差異表達LncRNA靶基因富集的GO term；0.2g?L-172h組差異表達LncRNA靶基因富集在GO的cellular metabolic process biological_process，binding molecular_function，FGF5處理組中只有10-4g?L-172 h組差異表達LncRNA靶基因富集在cell cellular_component、cell part cellular_component、intracellular cellular_component、binding molecular_function等6個條目。（4）靶基因KEGG富集分析結果顯示：1.0g?L-124h組差異表達LncRNA靶基因富集在Steroid biosynthesis pathway；0.2g?L-124h組無差異表達LncRNA靶基因富集的Pathway term；0.2g?L-172h組差異表達LncRNA靶基因富集在Cell cycle，DNA replication，Steroid biosynthesis，TNF，Nod-like receptor，NF-kappa B等信號通路，其中TNF和NF-kappa B信號通路與絨毛生長相關。FGF5處理組中，10-4g?L-172 h組差異表達的LncRNA靶基因顯著富集到Fanconi anemia pathway，Huntington's disease，Metabolic pathway，Aminoacyl-tRNA biosynthesis等9個pathway term，其中Metabolic信號通路與絨毛生長相關；10-4g?L-124 h組差異表達的LncRNA靶基因無顯著富集的pathway term；10-6g?L-124 h組差異表達的LncRNA靶基因只富集在Taste transduction pathway。（5）NF-κB和TNF兩個信號通路中富集的靶基因TNFα、TNFAIP3（A20）、NFKBIA（IkBα）、NFKB2、IL8所對應的LncRNA有2個，分別為（Gene ID）：XLOC_005914；XLOC_018763；Metabolic信號通路中靶基因所對應的LncRNA有4個，分別為（Gene ID）：XLOC_011424、XLOC_009522、XLOC_009063、XLOC_01115。Real-time PCR結果顯示：LncRNA XLOC_011424、XLOC_011157、LncRNA XLOC_005914和XLOC_018763與高通量測序結果一致。【結論】 LncRNA XLOC_011424、XLOC_011157、LncRNA XLOC_005914和XLOC_018763可能通過調控與絨毛生長相關的NF-κB 、TNF或Metabolic信號通路，提高羊絨密度和長度，進而提高遼寧絨山羊絨產量及品質。

遼寧絨山羊；褪黑激素；FGF5；LncRNA；RNA-seq; 信號通路

0 引言

【研究意義】遼寧絨山羊是中國代表性的絨山羊品種，其體型較大，適應能力強，遺傳穩定性好。遼寧絨山羊是絨肉兼用的地方良種，該種絨山羊產絨量高，絨毛品質好，其絨毛是珍貴的紡織原料。因此，研究如何提高遼寧絨山羊羊絨產量及品質尤為重要。【前人研究進展】毛囊是皮膚中的附屬結構，可分為初級毛囊和次級毛囊，初級毛囊產毛，次級毛囊產絨[3]。哺乳動物被毛的生長替換是一個復雜的生理過程，被毛的替換與毛囊的周期性生長密切相關，一般一個生長周期內毛囊要經歷生長期、退行期和休止期三個階段[4]。環境、代謝水平和基因調控等因素都可影響絨山羊毛囊的周期性生長過程，有研究表明，很多的信號分子都在毛囊的形態發生過程中具有很重要的作用，褪黑激素(melatonin，MT)、催乳素(prolactin)、成纖維細胞生長因子5（fibroblast growth factor 5, FGF5）、甲狀腺素(thyroxine)等[5-6]。MT是由松果體分泌出來的一種高度保守的吲哚類激素[7]。它在很多細胞、組織和器官中都起到重要作用[8]。IBRAHEEM 等研究發現，催乳素和褪黑激素對次級毛囊的毛干伸長具有刺激作用[9]。Logan等發現，褪黑激素能夠抑制由α-黑素細胞刺激素（MSH）引起的黑素生成的增加[10]。有學者發現，皮膚組織是除松果體外，MT合成與代謝的又一重要的場所[11]。近年來，很多研究表明MT可能在毛發生理學中起重要作用，其受體（MT2和RORα）以毛發周期依賴性方式在小鼠皮膚中表達，抑制角質形成細胞凋亡[12-13]。另外，MT能夠改變山羊中羊絨生長周期的時間，外源性的MT能夠促進毛囊從休止期向生長初期轉變，延長生長初期[14-15]。有學者發現，褪黑激素可作為自由基清除劑和DNA修復誘導劑，代謝和增殖活性高的毛發生長初期毛球也可以利用褪黑素合成作為自身細胞保護策略[16]。FGF5是目前所發現的一種與絨毛生長有直接關系的基因之一。最早發現的安哥拉鼠被毛增長就是由于FGF5基因突變所致[17]。此后，很多研究者們開始了一系列有關FGF5與毛發生長的研究。2007年JAMES等人利用家貓作為實驗動物進行研究，結果顯示FGF5是影響家貓毛發長度的主要因素[18]。SUZUKI等利用體外注射蛋白產物的方法進行了驗證實驗，結果表明FGF5的蛋白產物在毛囊生長的不同時期都具有影響[19]。此外，有些學者發現FGF5在毛發生長及某些老鼠的脫毛過程中也具有調節作用[20]。KREGE等人發現FGF5能夠通過影響Sox2的表達從而對皮膚毛囊的再生起到非常重要的影響[21]。筆者一直致力于如何提高遼寧絨山羊的絨毛產量及品質的研究，通過大量的試驗，最終篩選出了MT和FGF5這兩種藥物，其中MT處理組中1.0g?L-124h、0.2g?L-124h、0.2g?L-172h三個處理條件最有利于遼寧絨山羊皮膚成纖維細胞的增殖與生長，FGF5處理組中10-4g?L-124 h、10-4g?L-172 h、10-6g?L-124 h三個處理條件最適宜遼寧絨山羊皮膚成纖維細胞的增殖與生長。長鏈非編碼RNA(long noncoding RNA, LncRNA)是由RNA聚合酶Ⅱ轉錄的無蛋白質編碼功能的調節性非編碼RNA，是一類新型的真核生物轉錄物[22]。目前，人們將其分為：正義LncRNA、反義LncRNA、雙向LncRNA、基因內LncRNA和基因間LncRNA 5種主要類型[23]。很多學者研究發現lncRNA在多種生命過程中發揮重要作用，并且在細胞及生物體中的調節方式有多種，例如某些LncRNA可作為轉錄調控因子（或共調控因子）上調或下調某些基因的表達[24]。某些LncRNA在一定程度上對細胞的分化與增殖、生長發育、器官生成、免疫應答及腫瘤發生等多個生命活動都有一定的調節作用[25-26]。Ren等通過將幽州黑山羊和渝東白山羊作為實驗動物進行研究，他們對色素沉著早期階段皮膚細胞中的LncRNA進行結構和表達分析，篩選出差異表達的LncRNA，并對LncRNA進行順式和反式靶基因的預測[27]。ZHU等發現，長鏈非編碼RNA H19轉錄物與毛囊重建的真皮乳頭細胞的誘導能力有關，在次生毛囊中，lncRNA-H19轉錄物在毛發生長初期階段的相對表達顯著高于毛發生長終期階段和毛發生長中期階段，表明lncRNA-H19轉錄物可能在山羊絨絨纖維的形成和生長中起重要作用[28]。LIN等在毛乳頭細胞中發現了有助于毛發生長相關基因表達的LncRNA的表達[29]。有學者通過高通量測序技術對綿羊的LncRNA進行了生物信息學分析, 對綿羊基因組的研究有重大幫助[30]。【本研究切入點】近年來，關于如何提高羊絨產量及品質的研究越來越多。但是，有關MT和FGF5兩種藥物能否通過影響相關LncRNA的表達進而提高羊絨產量及品質的研究非常少。【擬解決的關鍵問題】本試驗以遼寧絨山羊為研究對象，分別用MT和FGF5處理遼寧絨山羊皮膚成纖維細胞，通過高通量測序技術篩選出差異表達的LncRNA，預測差異表達LncRNA的靶基因，并通過GO和KEGG富集分析篩選出與絨毛生長相關的LncRNA并進行Real-time PCR驗證。

1 材料與方法

1.1 細胞培養與藥物處理

試驗于2016年在遼寧師范大學生命科學學院，遼寧省生物技術與分子藥物研發重點實驗室進行。遼寧絨山羊皮膚成纖維細胞原代培養，用不同濃度及時間的MT和FGF5進行處理, 處理的條件分別為：MT處理組 1.0g?L-124h（M1_24H)、0.2g?L-124h（M2_24H)、0.2g?L-172h（M2_72H)； FGF5處理組，10-4g?L-124 h（F4_24H）、10-4g?L-172 h（F4_72H）、10-6g?L-124 h（F6_24H）。

1.2 提取RNA

參照寶生物工程(大連)有限公司的 DNase I(RNase Free)使用說明進行操作。

1.3 RNA-Seq文庫測序

由北京諾禾致源生物信息科技有限公司提供測序服務，測序平臺為 Illumina HiseqTM2500，以PE125的測序策略進行測序。利用fastx_toolkit(v0.0.14)軟件對得到的Raw reads進行分析。應用Illumina Casva1.8軟件通過QPhred=-10log10(e)公式對堿基的質量進行檢測。

1.4 Mapping以及樣品相關性檢驗

利用Tophat 2(V2.0.9)對過濾后的測序序列與山羊參考基因組進行比對分析，應用cufflinks和scripture軟件進行轉錄本的拼接。

1.5 差異表達LncRNA的篩選

首先通過五步篩選法進行基本的篩選，然后利用CPC、CNCI、pfam蛋白結構域及PhyloCSF分析方法進行編碼潛能的篩選，這幾種方法篩選的交集為候選的LncRNA。然后從候選LncRNA中篩選出差異表達的LncRNA

1.6 差異表達的LncRNA靶基因預測

LncRNA是通過與其靶基因mRNA相互作用來發揮作用的，因此采用Pearson相關系數法分析各樣本中LncRNA與蛋白編碼基因的表達量相關性和共表達分析方法來預測其靶基因。使用cuffdiff（http:// cufflinks.cbcb.umd.edu/manual.html#cuffdiff）軟件對篩選所得到的LncRNA進行定量分析，從而得到各樣品中LncRNA的FPKM信息。

1.7 差異表達LncRNA靶基因的功能富集分析

將差異表達LncRNA的cis和trans靶基因分別做GO和KEGG富集分析。

1.8 目標LncRNA的表達驗證

首先培養遼寧絨山羊皮膚成纖維原代細胞，用0.2g?L-1的MT和10-4g?L-1的FGF5分別處理細胞72h后，提取RNA并反轉錄成cDNA，接下來通過Real-time PCR對差異表達的LncRNA進行驗證，引物見表1。

2 結果

2.1 樣品總RNA電泳檢測

經過 DNase I(RNase Free)處理，得到遼寧絨山羊皮膚成纖維細胞總RNA樣品，然后對各組樣品進行瓊脂糖凝膠電泳。結果顯示試驗中提取的遼寧絨山羊皮膚成纖維細胞樣品的總RNA 瓊脂糖凝膠電泳檢測條帶清晰，無拖尾和降解現象，表明提取的 RNA 完整性良好，可以用于后續分析（圖1）。

表1 RT-PCR引物序列

2.2 測序數據質量評估

對RNA-Seq測序得到的數據質量進行檢測的結果如表2.1所示。通過表中數據可知，Error rate表示測序錯誤率，它與堿基質量有關，同時也受測序儀本身、測序試劑、樣品等多個因素共同影響，由表中數據可知堿基錯誤率較低。Q = -10log10p，其中p值是由Phred計算出，它表示一個堿基被識別錯誤的可能性，Q 值為 10 表示這個堿有90%的概率是正確的, 20 就是 99%。各個樣品中絕大部分reads的Q值均大于20。基GC含量相對較高，表明測序序列較穩定。綜上，我們認為各個樣品的測序序列都具有較高的質量，可以進行后續分析。

圖A為MT處理組，圖B為FGF5處理組。圖A中泳道1、2、3、4分別為M2_72H組、M2_24H組、M1_24H組和對照組C；圖B中泳道1、2、3、4分別為F4_24H組、F6_24H組、F4_72H和對照組C

2.3 Mapping

通過Tophat 2軟件將試驗中樣品的clean reads分別與NCBI中山羊參考基因組進行比對分析，發現試驗中所產生的測序序列定位百分比均低于70%，其中具有多個定位的測序序列占總體的百分比也均低于10%，表明試驗中參考基因組選擇合適，不存在污染。而且所有樣品中Unique Mapping Rate均為80%以上，因此可進行下一步分析。從圖2中可以更加直觀看出染色體長度和reads總數的關系，染色體的長度與定位到該染色體內reads總數呈正相關，MT處理組和FGF5處理組樣品比對到山羊1號、2號染色體上的reads相對來說都比較多。

2.4 樣品間相關性檢查

樣品間表達水平相關性是檢驗試驗可靠性和樣本選擇是否合理的重要指標。如圖3所示，可知各處理組與對照組相比較，2值均大于0.8, 表明樣品間表達水平相關性均較高。因此本試驗所選擇的樣品均符合測序要求，可以繼續進行下一步分析。

2.5 差異表達的LncRNA的篩選

篩選的條件是P-adjust <0.05，log2(Fold change) >1。由圖4可知，在M1_24H與C進行比較，獲得32個差異表達的LncRNA，其中有4個LncRNA上調，28個下調；M2_24H與C組進行比較，獲得10個差異表達的LncRNA，其中有4個LncRNA上調，6個下調；M2_72H與C組中進行比較，獲得113個差異表達的LncRNA，其中有5個LncRNA上調，108個下調；F6_24H與C進行比較，獲得123個差異表達的LncRNA，27個上調，96個下調；F4_24H與C進行比較，獲得164個差異表達的LncRNA，70個上調，94個下調；F4_72H與C組中進行比較，獲得189個差異表達的LncRNA，其中有78個上調，111個下調。

根據不同樣品中差異表達的LncRNA表達水平的高低，進行層次聚類（hierarchical clustering）分析，從而判斷這些LncRNA在不同試驗條件下的表達模式（圖5）。結果顯示在F4_24H組和M2_72H中差異表達的LncRNA表達水平相對較高。

橫坐標：染色體的長度信息（以百萬堿基為單位）；縱坐標：log2（reads的密度的中位數）；綠色為正鏈，紅色為負鏈

表2 RNA-Seq數據一覽表

樣品名稱：_1代表左端的reads，_2代表右端的reads；Raw reads：統計原始序列數據；Clean reads：過濾后的測序數據；Clean bases：測序序列個數與其長度的積；Error rate：堿基錯誤率；Q20、Q30：Phred 數值大于20、30的堿基與總堿基數之比；GC含量：含有G和C的堿基數量與占總堿基數之比

Sample_name: _1 represents reads of the left side, _2 represents reads of the right side; Raw reads: The original sequence data; Clean reads: The filtered sequencing data; Clean bases: The product of the number of sequencing sequence and the length of sequencing sequence; Error rate: Base error rate; Q20, Q30: The percentage of the bases that phred values are greater than 20 or 30 and all the bases; GC content: The percentage of the number of G and C bases and all the bases

圖3 各處理組中樣品間相關性檢查

有顯著性差異表達的轉錄本用紅色點（上調LncRNA）和綠色點（下調LncRNA）表示；橫坐標代表LncRNA表達水平變化；縱坐標代表LncRNA表達變化的統計學意義

2.6 差異表達的LncRNA靶基因Gene Ontology功能顯著性富集分析

分別根據LncRNA臨近位置的（上下游10k /100k）蛋白編碼基因和LncRNA與蛋白編碼基因的表達量相關性分析或共表達分析方法來預測其cis/trans靶基因。再對靶基因分別進行cis和trans的GO富集分析，分別從生物過程（biological process，BP）、分子功能（molecular function，MF）和細胞組分（cellular component，CC）三個層面對靶基因進行GO注釋。結果如表3、4所示：M2_24H vs C、F4_24H vs C和 F6_24H vs C組中差異表達的LncRNA均無顯著富集的條目；M1_24H vs C組中差異表達LncRNA的trans靶基因無顯著富集的GO term，其cis靶基因只在BP中有一個顯著富集的GO term，即negative regulation of transcription from RNA polymerase II promoter；M2_72H vs C和F4_72H vs C組中差異表達的LncRNA的cis靶基因均無顯著富集的GO term，而M2_72H vs C組trans靶基因主要富集在BP的cellular metabolic process biological_process、nitrogen compound metabolic process biological_process；MF中的binding molecular_function、catalytic activity molecular_function；CC中的membrane- bounded organelle cellular_component、F4_72H vs C組中差異表達的LncRNA的 rans靶基因主要富集在BP的cellular metabolic process biological_process、cellular macromolecule metabolic process biological_process，CC的cell cellular_component、cell part cellular_component、intracellular cellular_component，MF的binding molecular_ function中。

2.7 差異表達的LncRNA靶基因Pathway顯著性富集分析

通過KEGG數據庫，對樣品中差異表達LncRNA的靶基因進行通路富集分析，得到各比較組合中顯著性富集（Qvalue<0.05）的pathway term。結果如表5—9所示：M2_24H vs C和F4_24H vs C組中均無顯著富集的pathway term；F6_24H vs C組中差異表達的LncRNA的trans靶基因無顯著富集的pathway term，其cis靶基因只富集在Taste transduction通路；M2_72H vs C、M1_24H vs C和F4_72H vs C組中差異表達的LncRNA的cis靶基因均無顯著富集的pathway term，M2_72H vs C 組差異表達的LncRNA的trans靶基因顯著富集到15個pathway term，其中TNF和NF-kappa B 信號通路與毛囊發育及絨毛周期性生長相關，其通路中差異表達的靶基因、M1_24H vs C組差異表達的LncRNA的trans靶基因只富集在Steroid biosynthesis通路、F4_72H vs C組中差異表達的LncRNA的trans靶基因顯著富集到9個pathway term，其中只有Metabolic信號通路與毛囊發育及絨毛周期性生長相關，其通路中差異表達的靶基因。

每列代表一個樣品，每行代表一種基因；紅色代表高表達LncRNA，藍色代表低表達LncRNA

2.8 目標LncRNA的表達驗證

M2_72H組LcRNA靶基因富集的NF-κB信號通路中靶基因所對應的LncRNA有兩個，分別為（Gene ID）：XLOC_005914；XLOC_018763。F4_72H 組靶基因富集的Metabolic 信號通路中靶基因所對應的LncRNA有4個，分別為（Gene ID）：XLOC_011424、XLOC_009522、XLOC_009063、XLOC_01115。通過Real-time PCR對篩選出的6個LncRNA進行驗證，結果如圖7所示，MT作用相關的兩個LncRNA在RNA- Seq中的表達量上調，Real-time PCR檢測結果與RNA- Seq測序結果一致，進一步驗證了RNA-Seq測序結果的準確性。FGF5處理遼寧絨山羊皮膚成纖維細胞后，Real-time PCR結果為LncRNA XLOC_011424和XLOC_011157表達量下調；LncRNAXLOC_009063表達量上調; LncRNA XLOC_009522表達量無顯著性差異。結合RNA-Seq測序中4個LncRNA表達量均下調的結果，表明LncRNA XLOC_011424、LncRNA XLOC_011157與前期結果一致。

表3 M2_72H vs C組差異表達LncRNA靶基因GO term分類

?*：P<0.05

表4 F4_72H vs C組差異表達LncRNA靶基因的GO term分類

表5 M2_72H vs C組Pathways富集數據表

樣本編號：已注釋到該條通路中，同時在表達水平上有統計學意義的基因總數；背景編號：該條通路中所有的基因數

Sample number: The number of comment the differentially expressed genes in this pathway；Background number: The number of all genes in this pathway

表6 M2_72H vs C組差異表達基因富集的絨毛生長相關信號通路

表7 FGF處理組，KEGG富集分析

表8 FGF處理組，Pathways顯著性富集數據表

樣本編號：已注釋到該條通路中，同時在表達水平上有統計學意義的基因總數；背景編號：該條通路中所有的基因數

Sample number: The number of comment the differentially expressed genes in this pathway；Background number: The number of all genes in this pathway

表9 F4_72H vs C組差異表達基因富集的絨毛生長相關信號通路

3 討論

本試驗通過KEGG富集分析，共篩選出了3個與絨毛生長相關的信號通路，分別為TNF、NF-κB和Metabolic信號通路。

KLOEPPERT等研究發現，NF-κB在維持人類毛囊的生長期階段具有功能重要性。人類毛發生長初期，頭皮毛囊快速增殖的毛發基質上皮中，NF-κB活性非常顯著，關鍵的毛發生長調節劑如TNFα和IL-1通過調控NF-κB信號通路從而影響絨毛生長[35]。核因子（NF）-κB途徑參與毛囊的形態發生，Gilon M、Sher N、Cohen S和 Gat U通過瞬時轉染技術分析了p65 / RelA（一種NF-kB效應子）對毛發角蛋白（HK）調節區的影響，結果表明p65能夠誘導人和小鼠來源的幾種酸性毛發角蛋白5（Ha5）的轉錄激活，p65與Ha5基因調節區域中的NF-κB/ RelA結合位點直接結合[36]。NF-κB/ Rel轉錄因子和IkappaB激酶（IKK）參與骨形態發生，皮膚增殖和分化等過程。另外，Schmidt-Ullrich等研究發現，抑制NF-κB的小鼠會出現毛囊缺陷[37]。皮膚干細胞可以再生表皮附屬物。然而，由于受傷而損失的毛囊幾乎沒有再生。Wang等研究顯示，傷口中的巨噬細胞激活毛囊干細胞，導致傷口周圍的毛囊在休止期向生長期過渡，毛囊再生等過程，主要通過TNF信號傳導調控[38]。LAURIKKALA等發現，外異蛋白（ED1）和外異蛋白A受體（EDAR）作為新的TNF配體-受體對的鑒定表明，TNF信號在胚胎形態發生中的作用，另外他們認為ED1/EDAR信號傳導也調節毛囊的形態發生[39]。

蛋白質是生命活動的主要承擔者，而氨基酸是構成蛋白質分子的基本單位。L-半胱氨酸目前被認為是條件必需的硫氨基酸，不僅是角蛋白的關鍵組分，還可以促進許多生物途徑[40]。角蛋白相關蛋白8.1基因（KAP8.1）是一種負責羊絨的結構基因。KAP8.1蛋白含有高甘氨酸和酪氨酸，參與基質結構纖維的調節。ZHAO等認為KAP8.1基因的多態性可能與纖維直徑有關[41]。TONG等發現，原代培養物中的角蛋白17（K17）無效時，皮膚角質形成細胞對TNFα選擇性更敏感。K17與TNF受體1（TNFR1）相關的死亡域蛋白（TRADD）相互作用，這是一種必需的死亡適配體TNFR1依賴性信號傳遞，而且NF-κB（TNFα的下游靶標）的活性在K17無效皮膚中增加[42]。Wnt信號通路是毛囊發育中重要的途徑之一，次級毛囊中成纖維細胞生長因子21和酪蛋白激酶是Wnt途徑中β-連環蛋白的重要調節因子。天冬酰胺和絲氨酸可能在初級毛囊生長過程中具有重要作用[43]。由此可見，Metabolic、NF-kB 、TNF三個信號通路對絨毛生長發育有著十分重要的作用。

LncRNA是影響絨毛生長的重要因素之一。近幾年，關于LncRNA影響絨毛生長的研究越來越多。BAIA等研究表明，LncRNA（LncRNA-599618、-599556、-599554、-599547、-599531和-599509）在毛發生長初期階段的表達量顯著高于毛發生長終期階段[31]。CAI 等發現，LncRNA5322能夠通過靶向毛囊干細胞中miR-21介導的PI3K-AKT信號傳導途徑來促進毛囊干細胞的增殖和分化[32]。ZHOU 等在山羊皮膚中鑒定了1 122種已知的和403種新的LncRNA，其中173種在毛發生長初期和退化期之間差異表達。另外他們發現，LncRNA和miRNA在毛囊生長轉變中協同作用，并且退行期誘導因子（TGFβ1和BDNF）在miRNA-miRNA-mRNA網絡中由miR-873和Lnc108635596調節[33]。Song等研究表明，LncRNA XLOC_539599，XLOC_556463，XLOC_015081，XLOC_1285606，XLOC_297809和XLOC_764219對原發性羊毛毛囊誘導具有潛在的重要性，且差異表達的LncRNA的潛在靶基因在NF-κB信號通路顯著富集[34]。

本試驗，利用高通量測序和Real-time PCR技術在Metabolic、NF-kB 、TNF 3個信號通路靶基因對應的LncRNA中共篩選出4個與遼寧絨山羊絨毛生長相關的LncRNA，分別為：LncRNA XLOC_ 011424、XLOC_011157、XLOC_005914、XLOC_ 018763。因此，可以認為MT和FGF5兩種藥物處理，可通過影響某些相關LncRNA的表達，進而影響絨毛生長。

4 結論

LncRNA XLOC_011424、XLOC_011157、XLOC_ 005914和XLOC_018763可能通過增加羊絨密度及長度，進而提高遼寧絨山羊羊絨產量及品質。其中，前兩個LncRNA通過調節其上游或下游的靶基因，調節TNF或NF-kB信號通路，進而影響絨毛的生長。LncRNA XLOC_011424和XLOC_011157通過調節其與Metabolic pathway相關的靶基因從而影響絨毛生長。筆者所選擇的兩種藥物中，MT更能引起某些與絨毛生長相關LncRNA的差異表達從而影響絨毛生長。但是這4種LncRNA具體的功能和作用機制尚不清楚，后續試驗研究將集中探討LncRNA促進絨毛纖維生長的作用機制。

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（責任編輯 林鑒非）

The Screening and Identification of Lncrna Related to Villus Growth in Liaoning Cashmere Goats by MT and FGF5

Jin Mei, Zhang LiJuan, Cao Qian, Guo XinYing

(Liaoning Normal University School of Life Sciences, Liaoning Provincial Key Laboratory of Biotechnology and Molecular Drug Development, Dalian 116029, Liaoning)

【Objective】 The aim of this study was to screen out the LncRNA associated with villus growth in Liaoning cashmere goat skin fibroblasts, and provide basic data for the study of the function and mechanism of LncRNA related to villus growth. 【Method】The total RNA of MT and FGF5 treated Liaoning cashmere goat skin fibroblasts was extracted, and the total RNA extracted was detected by total RNA electrophoresis detection, sequencing data quality evaluation, mapping comparison and inter-sample correlation test. The differentially expressed LncRNA was screened and its target gene was predicted. The LncRNA related to villus growth was screened by GO and KEGG enrichment analysis, and the target LncRNA was verified by Real-time PCR. 【Result】(1) The total RNA quality of the sample showed that the RNA was in good integrity, the GC content was relatively high, the sequence was stable, and the expression level between samples was high, which met the sequencing requirements.(2) Screening of differentially expressed LncRNA showed that there were 32 differentially expressed LncRNA in 1.0g?L-124h group, 4 of which were up-regulated and 28 of which were down-regulated. There were 10 differentially expressed LncRNA in 0.2g?L-124h group, 4 of which were up-regulated and 6 were down-regulated. There were 113 differentially expressed LncRNA in the 0.2g?L-172h group, of which 5 were up-regulated and 108 were down-regulated. There were 164 differentially expressed LncRNA in the 10-4g?L-124 h group, of which 70 were up-regulated and 94 were down-regulated. There were 189 differentially expressed LncRNA in the10-4g?L-172 h group, of which 78 were up-regulated and 111 were down-regulated. There were 123 LncRNA differentially expressed in the 10-6g?L-124 h group, among which 27 up and 96 down.(3) Target gene GO enrichment analysis showed that the 1.0g?L-124h group differentially expressed LncRNA target gene enrichment in GO's negative regulation of transcription from RNA polymerase II promoter; 0.2g?L-124h group did not differentially express LncRNA target gene enriched GO term;0.2g?L-172h group Differentially expressed LncRNA target gene enrichment in GO's cellular metabolic process biological_process, binding molecular_function, FGF5 treatment group only10-4g?L-172 h group differentially expressed LncRNA target gene enriched in cell cellular_component, cell part cellular_component, intracellular cellular_component, binding molecular_function and other six items. (4) Target gene KEGG enrichment analysis showed that the differential expression of LncRNA target gene in 1.0g?L-124h group was enriched in Steroid biosynthesis pathway; in 0.2g?L-124h group, there was no differential expression of LncRNA target gene enrichment Pathway term; 0.2g?L-172h group differentially expressed LncRNA target gene enrichment in Cell cycle, DNA replication, Steroid biosynthesis, TNF, Nod-like receptor, NF-kappa B and other signaling pathways, in which TNF and NF-kappa B signaling pathways are involved in villus growth. In FGF5-treated group, differentially expressed LncRNA targets in 10-4g?L-172 h group The gene was significantly enriched into nine path termes such as Fanconi anemia pathway, Huntington's disease, Metabolic pathway, Aminoacyl-tRNA biosynthesis, among which Metabolic pathway was associated with villus growth; the differentially expressed LncRNA target gene in 10-4g?L-124 h group had no significant enriched pathway term;10-6g?L-124 h The differentially expressed LncRNA target genes were only enriched in the Taste transduction pathway. (5) There are two LncRNA corresponding to the target genes TNFα, TNFAIP3 (A20), NFKBIA (IkBα), NFKB2 and IL8 enriched in NF-κB and TNF signaling pathways, respectively (Gene ID): XLOC_005914; XLOC_018763; There are four LncRNA corresponding to the target genes in the Metabolic pathway, namely (Gene ID): XLOC_011424, XLOC_009522, XLOC_009063, XLOC_01115. Real-time PCR results showed that LncRNA XLOC_011424, XLOC_011157, LncRNA XLOC_005914 and XLOC_018763 were consistent with high-throughput sequencing results. 【Conclusion】 LncRNA XLOC_011424, XLOC_011157, LncRNA XLOC_005914 and XLOC_018763 may increase the density and length of cashmere by regulating NF-κB, TNF or Metabolic signaling pathways related to villus growth, and thus improve the yield and quality of cashmere in Liaoning cashmere goat.

Liaoning cashmere goat; melatonin; FGF5; LncRNA; RNA-seq; signaling pathway

10.3864/j.issn.0578-1752.2019.04.014

2018-09-03；

2018-12-03

國家自然科學基金（31772557）、遼寧省自然科學基金（20170540577）

金梅，E-mail：jm6688210@163.com