LncRNA SOX21-AS1靶向調控miR-202-5p影響結直腸癌細胞生物學行為的實驗研究*

劉艷紅 陳文霞 屈重行 李琨琨 姜媛媛 吳慧麗

鄭州大學附屬鄭州中心醫院消化內科(450007)

背景：長鏈非編碼RNA(lncRNA)可通過調控miRNA的表達來參與腫瘤發生、發展過程，但lncRNA在結直腸癌發展和轉移中的分子機制尚未闡明。目的：探討lncRNA SOX21-AS1通過調控微小RNA-202-5p(miR-202-5p)的表達影響結直腸癌細胞生物學過程的分子機制。方法：以SOX21-AS1小分子干擾RNA(si-SOX21-AS1)、miR-202-5p模擬物及其抑制劑轉染結直腸癌HCT116、SW480細胞，采用實時熒光定量聚合酶鏈反應(qRT-PCR)法檢測結直腸癌細胞株SOX21-AS1、miR-202-5p mRNA表達，MTT法檢測細胞增殖情況，流式細胞術檢測細胞凋亡情況，Transwell實驗檢測細胞遷移和侵襲情況，雙螢光素酶報告實驗檢測SOX21-AS1與miR-202-5p的靶向調控關系，蛋白質印跡法檢測細胞周期蛋白1(cyclin D1)、MMP-2、cleaved caspase-3蛋白表達。結果：結直腸癌細胞中SOX21-AS1 mRNA表達顯著高于人正常結腸黏膜上皮細胞(P<0.05)，miR-202-5p mRNA表達顯著降低(P<0.05)。沉默SOX21-AS1或上調miR-202-5p表達可顯著抑制HCT116、SW480細胞增殖、遷移和侵襲，細胞凋亡率顯著增加(P<0.05)，并可抑制cyclin D1、MMP-2蛋白表達(P<0.05)，促進cleaved caspase-3蛋白表達(P<0.05)。SOX21-AS1可靶向結合miR-202-5p，并可負向調控miR-202-5p的表達和活性；抑制miR-202-5p表達可逆轉沉默SOX21-AS1對結直腸癌細胞增殖、凋亡、遷移和侵襲的影響。結論：沉默SOX21-AS1表達可通過上調miR-202-5p的表達從而抑制結直腸癌細胞增殖、遷移和侵襲，并可誘導細胞凋亡。

結直腸癌是一種發病率和死亡率均較高的惡性腫瘤，腫瘤生長、惡性進展是結直腸癌患者死亡的主要原因[1]。目前臨床多采用手術、靶向治療、免疫治療等手段治療結直腸癌，但患者的預后較差[2]。既往研究顯示癌基因的激活或抑癌基因的失活等可增強腫瘤細胞侵襲能力從而促進結直腸癌的惡性轉移[3]。目前結直腸癌的致病機制尚未完全闡明，需進一步探究結直腸癌發展、轉移的分子機制。長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA, lncRNA)在不同疾病中的表達趨勢不同，可參與細胞增殖、分化等生物學過程，有研究表明lncRNA SOX21-AS1可能促進結直腸癌的發生[4]。SOX21-AS1還可通過競爭性結合微小RNA-7(microRNA-7, miR-7)來促進宮頸癌的進展[5]。但SOX21-AS1在結直腸癌發展、轉移過程中的分子機制尚未完全闡明。通過DIANA預測發現SOX21-AS1與miR-202-5p存在靶向序列。有研究表明miR-202-5p通過直接靶向SMARCC1在結直腸癌中發揮抑癌作用[6]。LncRNA NORAD通過抑制miR-202-5p表達來促進結直腸癌的進展[7]。本研究通過在不同結直腸癌細胞株中沉默SOX21-AS1表達或上調miR-202-5p表達，旨在驗證SOX21-AS1對miR-202-5p表達的調控作用，從而探討SOX21-AS1調控結直腸癌發生、轉移的分子機制。

材料與方法

一、主要材料與試劑

人正常結腸黏膜上皮細胞NCM460購自上海聯邁生物工程有限公司；人結直腸癌細胞株HCT116、SW480、SW620、LoVo、HT29購自中國科學院上海細胞庫。DMEM培養基、胰蛋白酶、Lipofectamine 2000轉染試劑盒均購自美國Thermo Fisher公司；SOX21-AS1小分子干擾RNA(si-SOX21-AS1)、無意義陰性序列(si-con)、miR-202-5p模擬物(mimics)、陰性對照(miR-con)、miR-202-5p特異性寡核苷酸抑制劑(anti-miR-202-5p)及其陰性對照(anti-miR-con)均購自廣州銳博生物科技有限公司；Trizol、反轉錄試劑盒、SYBR Green試劑盒均購自寶生物工程(大連)有限公司；甲基噻唑基四唑(methylthiazolyl tetrazolium, MTT)購自北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司；細胞凋亡檢測試劑盒購自美國Sigma公司；Transwell小室、Matrigel基質膠均購自美國Corning公司；雙螢光素酶報告基因檢測試劑盒購自威格拉斯生物技術(北京)有限公司；蛋白裂解液、BCA蛋白定量試劑盒購自北京全式金生物技術有限公司；兔抗人細胞周期蛋白D1(cyclin D1)、活化的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶-3(cleaved caspase-3)、基質金屬蛋白酶-2(matrix metallopro-teinases-2, MMP-2)單抗購自美國CST公司；辣根過氧化物酶(HRP)標記的山羊抗兔二抗購自武漢艾美捷科技有限公司。

二、方法

1. 細胞轉染和分組：所有細胞培養于DMEM培養基，置于37 ℃、5% CO2培養箱內培養，傳代培養。收集對數生長期結直腸癌HCT116、SW480細胞，胰蛋白酶消化，制備細胞懸液接種于24孔板，待細胞生長融合至70%時進行轉染，轉染前更換為不含胎牛血清的DMEM培養基，隨機分為NC組(未經任何處理的細胞)、si-con組(轉染si-con的細胞)、si-SOX21-AS1組(轉染si-SOX21-AS1的細胞)、miR-con組(轉染miR-con的細胞)、miR-202-5p組(轉染miR-202-5p mimics的細胞)、si-SOX21-AS1+anti-miR-con組(共轉染si-SOX21-AS1與anti-miR-con的細胞)、si-SOX21-AS1+anti-miR-202-5p組(共轉染si-SOX21-AS1與anti-miR-202-5p的細胞)，各組細胞轉染6 h后更換為含有10%胎牛血清和雙抗的DMEM培養基，繼續培養48 h，收集對數生長期細胞進行功能驗證實驗。

2. 實時熒光定量聚合酶鏈反應(qRT-PCR)檢測SOX21-AS1、miR-202-5p mRNA表達：收集各組細胞，采用Trizol法提取細胞總RNA，參照反轉錄試劑盒合成cDNA。SOX21-AS1正向引物：5’-TTT GCT TTC GAG CTA TGA-3’，反向引物：5’-CTT AAT TGC CTG ATA CGC-3’；GAPDH正向引物：5’-GGA GCG AGA TCC CTC CAA AAT-3’，反向引物：5’-GGC TGT TGT CAT ACT TCT CAT GG-3’；miR-202-5p正向引物：5’-ACA CTC CAG CTG GGT TCC TAT GCA TAT A-3’，反向引物：5’-CTC AAC TGG TGT CGT GGA GT-3’；U6正向引物：5’-ATT GGA ACG ATA CAG AGA AGA TT-3’，反向引物：5’-GGA ACG CTT CAC GAT TTG-3’，引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司設計并合成。以cDNA為模板進行qRT-PCR，參照試劑盒配置反應體系，反應條件：95 ℃ 2 min(循環1次)；95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s(循環40次)。SOX21-AS1以GAPDH為內參，miR-202-5p則以U6為內參，采用2-ΔΔCt法計算SOX21-AS1、miR-202-5p mRNA相對表達量。

3. MTT法檢測細胞增殖：收集各組對數生長期結直腸癌HCT116、SW480細胞，胰蛋白酶消化，制備單細胞懸液，調整細胞密度為3×104個/mL，按照每孔200 μL細胞懸液接種于96孔板，分別于轉染24 h、48 h、72 h時向每孔中加入20 μL MTT溶液(5 mg/mL)，室溫孵育4 h，棄上清，每孔分別加入150 μL二甲基亞砜(DMSO)，低速振蕩10 min，上酶標儀檢測波長490 nm處各孔吸光度值(A值)。

4. 流式細胞術檢測細胞凋亡：分別取各組對數生長期結直腸癌HCT116、SW480細胞，0.25%胰蛋白酶消化，收集細胞，室溫條件下1 000 r/min離心6 min(離心半徑6 cm)，棄上清，預冷PBS清洗，加入500 μL結合緩沖液，加入5 μL Annexin V-FITC，充分混勻，加入5 μL PI，室溫避光孵育10 min，應用流式細胞儀檢測細胞凋亡率。

5. Transwell實驗檢測細胞遷移：取對數生長期結直腸癌HCT116、SW480細胞，棄上清，0.25%胰蛋白酶消化，加入不含血清的DMEM培養基制備單細胞懸液，調整細胞密度為5×104個/mL，按照每孔200 μL將細胞懸液接種于24孔板Transwell小室的上室。取600 μL培養液(含有10%胎牛血清)加入Transwell小室的下室，放入37 ℃、5% CO2培養箱內培養24 h，PBS洗滌，多聚甲醛固定10 min，PBS洗滌，0.1%結晶紫染液染色10 min，擦拭未遷移細胞，顯微鏡下隨機選取5個視野觀察遷移細胞數。

6. Transwell實驗檢測細胞侵襲：以預冷培養液稀釋Matrigel基質膠(稀釋比例為9∶1)，24孔板Transwell小室上室每孔加入40 μL Matrigel稀釋液，置于37 ℃ 5% CO2培養箱孵育5 h。取對數生長期結直腸癌HCT116、SW480細胞，棄培養液，PBS洗滌，0.25%胰蛋白酶消化，加入不含胎牛血清的培養液制備單細胞懸液，調整細胞密度為5×104個/mL，按照每孔200 μL單細胞懸液Transwell小室的上室，37 ℃恒溫培養箱內培養24 h，PBS洗滌3次×5 min，多聚甲醛溶液固定10 min，0.1%結晶紫染液染色10 min，擦去未侵襲細胞，顯微鏡下隨機選取5個視野觀察侵襲細胞數。

7. 雙螢光素酶報告基因檢測：將螢光素酶報告載體SOX21-AS1-WT、SOX21-AS1-MUT分別與miR-202-5p mimics、miR-con共轉染結直腸癌HCT116、SW480細胞，轉染24 h后收集細胞，根據螢光素酶活性檢測試劑盒說明書檢測細胞相對螢光素酶活性。分別將si-con、si-SOX21-AS1、pcDNA、pcDNA-SOX21-AS1轉染各組結直腸癌HCT116、SW480細胞，采用qRT-PCR法檢測細胞中miR-202-5p mRNA表達。

8. 蛋白質印跡法檢測各組cyclin D1、MMP-2、cleaved caspase-3蛋白表達：收集各組結直腸癌HCT116、SW480細胞，加入蛋白裂解液提取細胞總蛋白，采用BCA法測定蛋白濃度，蛋白高溫變性，取30 μg變性蛋白進行SDS-PAGE電泳。電泳結束后將分離的蛋白凝膠轉移至PVDF膜，采用5%脫脂奶粉封閉2 h，室溫條件下孵育一抗(稀釋比例為1∶1 000)，搖床孵育過夜，TBST洗滌3次×15 min，孵育二抗(稀釋比例為1∶2 000)，搖床孵育1 h，TBST洗滌3次×15 min，曝光，顯影，凝膠成像分析系統，并應用Image J軟件分析各條帶灰度值。

三、統計學分析

結 果

一、SOX21-AS1和miR-202-5p在人結直腸癌細胞和人正常結腸黏膜上皮細胞中的表達

實驗結果顯示，與人正常結腸黏膜上皮細胞NCM460相比，結腸癌細胞HCT116、SW480、SW620、LoVo、HT29中SOX21-AS1表達顯著升高，miR-202-5p表達顯著降低(圖1)。其中SOX21-AS1在結直腸癌HCT116、SW480細胞中的表達較其他細胞株明顯升高，miR-202-5p在結直腸癌HCT116、SW480細胞中的表達相對較低，因而選用結直腸癌HCT116、SW480細胞為研究對象進行后續實驗。

*與NCM460細胞比較，P<0.05

圖1人結直腸癌細胞和人正常結腸黏膜上皮細胞中SOX21-AS1、miR-202-5p表達(qRT-PCR法)

二、沉默SOX21-AS1表達對人結直腸癌細胞增殖和細胞凋亡的影響

與si-con組相比，si-SOX21-AS1組結直腸癌HCT116、SW480細胞中SOX21-AS1 mRNA表達顯著降低(P<0.05；圖2A、2B)，提示轉染成功。與si-con組相比，si-SOX21-AS1組結直腸癌HCT116、SW480細胞活力顯著降低(P<0.05；圖2C、2D)，細胞凋亡率顯著升高(P<0.05；圖2E-2H)，cyclin D1蛋白表達顯著降低(P<0.05)，cleaved caspase-3蛋白表達顯著升高(P<0.05；圖2I-2K)；而si-con組上述指標與NC組相比差異均無統計學意義(P>0.05；圖2)。

*與si-con組比較，P<0.05

A-B：qRT-PCR法檢測SOX21-AS1 mRNA表達；C-D：MTT法檢測細胞活力；E-H：流式細胞術檢測細胞凋亡；I-K：蛋白質印跡法檢測cyclin D1和cleaved caspase-3蛋白表達

圖2 沉默SOX21-AS1表達對人結直腸癌HCT116和SW480細胞增殖和凋亡的影響

三、沉默SOX21-AS1表達對人結直腸癌細胞遷移和侵襲的影響

與si-con組相比，si-SOX21-AS1組結直腸癌HCT116、SW480細胞遷移和侵襲能力均顯著降低(P<0.05)，MMP-2蛋白表達顯著降低(P<0.05)；而si-con組上述指標與NC組相比差異均無統計學意義(P>0.05；圖3)。

*與si-con組比較，P<0.05

圖3 沉默SOX21-AS1表達對人結直腸癌HCT116和SW480細胞遷移和侵襲的影響

四、SOX21-AS1靶向調控miR-202-5p表達

通過DIANA預測到SOX21-AS1與miR-202-5p存在靶向序列(圖4A)。雙螢光素酶報告實驗結果顯示，轉染克隆有SOX21-AS1-3’UTR突變型載體質粒實驗中，miR-202-5p組與miR-con組螢光素酶活性相比無明顯差異；轉染克隆有SOX21-AS1-3’UTR野生型載體質粒實驗中，miR-202-5p組螢光素酶活性顯著低于miR-con組(P<0.05；圖4B、4C)。qRT-PCR檢測結果顯示si-SOX21-AS1組結直腸癌HCT116、SW480細胞中miR-202-5p mRNA表達顯著高于si-con組(P<0.05)，pcDNA-SOX21-AS1組結直腸癌HCT116、SW480細胞中miR-202-5p表達顯著低于pcDNA組(P<0.05；圖4D、4E)。

*與miR-con組比較，P<0.05；#與si-con組比較，P<0.05；▲與pcDNA組比較，P<0.05

A：SOX21-AS1與miR-202-5p存在靶向序列；B-C：螢光素酶報告實驗結果；D-E：結直腸癌細胞HCT116和SW480中miR-202-5p表達

圖4 SOX21-AS1靶向調控miR-202-5p的表達

五、MiR-202-5p模擬物對人結直腸癌細胞增殖、凋亡、遷移和侵襲的影響

實驗結果顯示，與miR-con組相比，miR-202-5p組結直腸癌HCT116、SW480細胞中miR-202-5p mRNA表達顯著升高(P<0.05；圖5A、5B)，提示轉染成功。與miR-con組相比，miR-202-5p組結直腸癌HCT116、SW480細胞活力顯著降低(P<0.05)，遷移、侵襲細胞數顯著減少(P<0.05)，細胞凋亡率顯著增高(P<0.05)，cyclin D1、MMP-2蛋白表達顯著降低(P<0.05)，cleaved caspase-3蛋白表達顯著升高(P<0.05；圖5C-5K)。

*與miR-con組比較，P<0.05

A-B：qRT-PCR法檢測miR-202-5p mRNA表達；C-D：MTT法檢測細胞活力；E-F：Transwell實驗檢測細胞遷移和侵襲；G-H：流式細胞術檢測細胞凋亡；I-K：蛋白質印跡法檢測cyclin D1、MMP-2和cleaved caspase-3蛋白表達

圖5 MiR-202-5p模擬物對人結直腸癌細胞增殖、凋亡、遷移和侵襲的影響

六、MiR-202-5p抑制物部分逆轉沉默SOX21-AS1對人結直腸癌細胞增殖、凋亡、遷移和侵襲的影響

與si-SOX21-AS1+anti-miR-con組相比，si-SOX21-AS1+anti-miR-202-5p組結直腸癌HCT116、SW480細胞中miR-202-5p mRNA表達顯著降低(P<0.05)，細胞活力顯著增強(P<0.05)，遷移和侵襲細胞數顯著增加(P<0.05)，細胞凋亡率顯著降低(P<0.05)，cyclin D1、MMP-2蛋白表達顯著升高(P<0.05)，cleaved caspase-3蛋白表達顯著降低(P<0.05；圖6)。

*與si-con組比較，P<0.05；#與si-SOX21-AS1+anti-miR-con組比較，P<0.05

A-B：qRT-PCR法檢測miR-202-5p表達；C-D：MTT法檢測細胞活力；E-F：Transwell實驗檢測細胞遷移和侵襲；G-H：流式細胞術檢測細胞凋亡；I-K：蛋白質印跡法檢測cyclin D1、MMP-2和cleaved caspase-3蛋白表達

圖6 抑制miR-202-5p表達可逆轉沉默SOX21-AS1對結直腸癌HCT116和SW480細胞增殖、凋亡、遷移和侵襲的影響

討 論

LncRNA可通過與miRNA、lncRNA-蛋白相互作用等多種機制參與惡性腫瘤的發生、發展進程，既往研究顯示部分lncRNA在結直腸癌組織中異常表達并可通過調控靶基因的表達來參與結直腸癌細胞增殖、凋亡等過程[8-10]。因此本研究積極探尋lncRNA在結直腸癌發生和轉移過程中的分子機制，對提高臨床治療效果以及改善患者預后均具有重要意義。

有研究[11]顯示SOX21-AS1在腎母細胞瘤中呈高表達并可促進細胞增殖。SOX21-AS1表達升高可預示肺腺癌、肝細胞癌患者的預后不良[12-13]。但SOX21-AS1在結直腸癌中的表達及其調控機制尚未完全闡明。本研究結果顯示不同結直腸癌細胞株中SOX21-AS1表達均顯著升高，表明SOX21-AS1在結直腸癌發生過程中可能發揮重要作用。進一步細胞實驗結果證實，沉默SOX21-AS1表達可顯著抑制結直腸癌細胞增殖、遷移和侵襲，并可促進細胞凋亡，提示沉默SOX21-AS1表達可降低結直腸癌細胞增殖、遷移和侵襲能力并誘導細胞凋亡，從而抑制癌癥進展。有研究表明cyclin D1可正向調控細胞周期進程，促進細胞生長；細胞接收凋亡信號時可激活線粒體凋亡途徑，激活細胞凋亡執行因子caspase-3形成cleaved caspase-3，從而促進細胞凋亡；細胞外基質降解可促進腫瘤細胞侵襲，其中MMP-2作為基質金屬蛋白酶家族成員，可通過降解細胞外基質成分從而促進結直腸癌細胞浸潤和轉移[14-16]。本研究結果顯示沉默SOX21-AS1表達可顯著抑制結直腸癌細胞中cyclin D1、MMP-2表達，并促進cleaved caspase-3表達，提示沉默SOX21-AS1表達可能通過上調cleaved caspase-3和下調cyclin D1、MMP-2表達，從而影響結直腸癌細胞增殖、遷移、侵襲和凋亡過程。

MiR-202在肺癌細胞中呈低表達，可通過抑制下游靶基因GLI-2表達來調控細胞增殖和凋亡過程[17]。LncRNA NORAD可通過靶向miR-202-5p促進肝細胞癌進展[18]。研究表明miR-202-5p可通過靶向ROCK1抑制骨肉瘤細胞遷移和侵襲[19]。本研究結果顯示不同結直腸癌細胞株中miR-202-5p表達顯著降低，細胞實驗證實上調miR-202-5p表達可抑制結直腸癌細胞增殖、遷移和侵襲，并促進細胞凋亡。同時雙螢光素酶報告實驗證實SOX21-AS1可靶向調控miR-202-5p表達，抑制miR-202-5p表達可部分逆轉沉默SOX21-AS1對結直腸癌細胞增殖、凋亡、遷移和侵襲的作用，說明沉默SOX21-AS1可通過上調miR-202-5p表達來改善結直腸癌細胞的惡性生物學行為。提示SOX21-AS1有望作為結直腸癌診斷和治療的潛在靶點。

綜上所述，SOX21-AS1在結直腸癌細胞中呈高表達，沉默SOX21-AS1表達可通過上調miR-202-5p表達進而影響結直腸癌細胞增殖、遷移、侵襲和凋亡過程，SOX21-AS1可通過負向調控miR-202-5p的表達從而促進結腸癌發生、發展，可為結直腸癌的靶向治療提供新方向。但結直腸癌的發生是一個多步驟、多因素的復雜過程，關于結直腸癌發生、轉移過程中miR-202-5p對下游靶基因和其他相關信號通路的調控作用仍需行進一步探討。