青海省6種高寒禾本科牧草的耐鹽性

李京蓉，馬 真，劉澤華，喬安海，鄧艷芳，王文穎，姚步青,，楊正榮，張春輝，周華坤,

（1. 中國科學院西北高原生物研究所 / 青海省寒區恢復生態學重點實驗室，青海 西寧 810001；2. 青海師范大學，青海 西寧 810008；3. 青海省草原總站，青海 西寧 810001；4. 青海大學省部共建三江源生態與高原農牧業國家重點實驗室，青海 西寧810016；5. 青海省鐵卜加草原改良試驗站，青海 鐵卜加 813000）

在全球范圍內，鹽是限制植被產量和品質的最重要的環境因素之一[1-2]。鹽堿化是當今世界荒漠化和耕地退化的主要原因之一，這也引起了科研人員對植物鹽堿抗性生理和生態的關注和研究[3]。在干旱半干旱地區，降水量少、蒸發量大、用水量不合理等因素是造成鹽脅迫的重要原因[4]。鹽脅迫環境通過影響作物生長發育而影響作物的產量[5]。青海省地處中國西北地區，干旱、半干旱、大面積的鹽堿地是制約當地農業和畜牧業發展的主要因素[6]。如何合理有效地利用和改善鹽堿地，對促進青海地區的農業和畜牧業發展具有積極意義。

青海省高寒草甸的禾本科牧草具有良好的適應性和耐鹽性[7]，可以用于改善鹽堿地。禾本科牧草的耐鹽性通常優于豆科牧草和普通作物[8]。在鹽脅迫條件下植物種子能否正常發芽及生長是植物生長發育及能否建植成功的先決條件[9-10]。因此，對鹽脅迫條件下禾本科牧草種子萌發和幼苗生長的研究具有重要意義。本研究所選6種牧草均屬禾本科多年生牧草，多分布于海拔高度3 000-4 300 m的天然草地，是改善干旱、鹽堿草地和栽培草地建植的優良草種，也是退化草地恢復和水土保持的重要草種[11]。但目前處于試驗階段，并未在生產建設中大規模使用。本研究對鹽脅迫條件下6種禾本科牧草萌發期和苗期的各指標變化情況進行分析，通過隸屬函數綜合評價供試禾本科牧草耐鹽能力的強弱，旨在對牧草耐鹽鑒定、耐鹽性新品種的選育和應用及鹽堿地的改良利用提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 供試材料

本研究選取了6種在青海省分布較為廣泛的禾本科牧草進行抗鹽性評價，詳情如表1所列。

表1 供試材料Table 1 Test materials

1.2 試驗方法

1.2.1 牧草萌發期試驗

種子處理：選擇成熟、飽滿、中等大小、均勻、無病的健康種子于1% NaCl溶液中浸泡15 min，然后用蒸餾水沖洗3遍并放置在鋪有3層濾紙的培養皿中，加入適量的NaCl溶液(濃度分別為 70、140 和 280 mmol·L-1)，對照 (CK)加入蒸餾水。培養皿放置于培養箱，溫度控制在20 ℃，每天光照12 h，每天加入相同體積的NaCl溶液，對照加蒸餾水，每4 d更換濾紙以使水勢的變化最小化。每個處理(包括CK)設4個重復，每個重復選用50粒種子。自種子置于培養箱中開始觀察，以胚芽長度等于發芽種子1/2的長度為標準。將重復中最早有1粒發芽的日期作為開始，此后每天記錄發芽種子的數量，當連續15 d不再有種子發芽時作為發芽結束期[12-14]，并按下式計算。

發芽率 = (正常發芽種子數/供試種子數) × 100%。

1.2.2 牧草苗期試驗方法

選擇土壤進行篩分，除去石頭及雜質，將沙∶有機肥∶土按1∶1∶4的混合基質置于塑料花盆中，用清水澆透，在花盆中均勻撒下消毒后的種子，用干土輕輕覆蓋，播種深度為1 cm。播種后，幼苗長至2～3片葉時進行間苗，每盆留30株。6種牧草每種5盆，共30盆。待生長到4～5片葉時進行NaCl處理。NaCl處理濃度分別為 50 、100 、150、200 mmol·L-1，對照用蒸餾水，每個處理4次重復。在NaCl處理前3 d對所有牧草進行澆水處理，使每盆土壤處于飽和含水狀態(土壤含水量保持在 22.8% ± 2.0%)。NaCl處理采用濃度梯度遞升的方式依次進行處理，14 d后分別對各生理指標進行測定。

1.3 牧草苗期生理指標測定及方法

1.3.1 丙二醛 (MDA)含量

將試驗材料磨成漿液于離心管中，離心10 min，上清液為萃取物，取上清液測其體積。在提取液中加入 2 mL 0.3% TBA 溶液，沸水浴中 15 min 后立即冷卻，再次離心15 min，取上清液，測定450、532、600 nm 波長的吸光度。根據 CMDA= 6.45(D532－D600) － 0.56D450，計算出MDA的濃度，再按下式得出MDA的含量[15-16]。

MDA 含量 = (MDA 濃度 × 提取液體積)/植物組織鮮重。

1.3.2 葉綠素相對含量

稱取剪碎的鮮樣0.3 g，于研缽中研磨成勻漿，加80%丙酮，繼續磨至組織變白，再過濾至25 mL容量瓶中，反復用丙酮清洗數次，最后用丙酮定容至25 mL。以80%丙酮為空白對照，測定470、646、663 nm波長下的吸光值。

Ca＝ 12.21D663－ 2.81D646；

Cb= 20.13D646－ 5.03D663；

葉綠素總濃度 C ＝ Ca＋ Cb；

Cx.c= (1 000D470－ 3.27Da－ 104Cb) / 229；

式中：Ca、Cb分別表示葉綠素a和葉綠素b的濃度；Cx.c表示類胡蘿卜素的總濃度。

根據下式計算組織中各色素的含量：

色素含量 = (色素濃度 C × 提取液總量 × 稀釋倍數 × 1 000) / 樣品葉片鮮重。

1.3.3 可溶性糖含量

將樣品置于試管中并封口，在沸水中提取30 min，冷卻后吸取0.5 mL提取液于加有1.5 mL蒸餾水的試管中，并依次加入0.5 mL的蒽酮乙酸乙酯和5 mL濃硫酸充分振蕩，逐管立即準確保溫1 min，蒸餾水作對照，測定其在630 nm波長下的吸光度值。

可溶性糖含量 = (C × V/a) / W；

式中：C為葡萄糖量，由標準曲線求得(μg)；V是提取液總體積(mL)；a為測定時所吸取的體積(mL)；W為樣品重(g)。

1.3.4 游離脯氨酸含量

用3%的磺基水楊酸在沸水浴中提取15 min后，用酸性茚三酮法顯色，然后用甲醛萃取，避光靜置4 h后，吸取甲苯層在520 nm波長下測定吸光度[1]。

脯氨酸 = (C × V/a) / W；

式中：C為四氮唑還原量(mg)，由標準曲線求得；V為提取液總體積(mL)；a為測定時所吸取的體積(mL)；W為樣品重(g)。

1.4 數據處理與分析

試驗所得數據通過 Microsoft Excel 2007 進行處理并作圖；用SPSS 20.0統計軟件對相同物種不同濃度間，以及相同濃度不同物種間的各項生理指標；用Student-Newman-Keuls方法進行在0.05顯著水平上的多重比較；用Origin制圖軟件制作插圖。

2 結果與分析

2.1 NaCl處理對6種禾本科牧草萌發期影響

草原看麥娘種子( Alopecurus pratensis)的萌發率在每個濃度梯度均顯著高于其余5種牧草(P ＜0.05)(圖 1)，除 NaCl濃度 280 mmol·L-1，扁穗冰草(Agropyron cristatum) 萌發率和其余 5 種牧草均存在顯著差異。而不同濃度NaCl同一物種間除扁穗冰草在 NaCl濃度 140和 280 mmol·L-1差異不顯著外，其余均存在顯著差異(P＜0.05)，且隨濃度的增大萌發率顯著下降。

2.2 NaCl處理對6種禾本科牧草苗期各生理指標影響

2.2.1 6種禾本科牧草丙二醛含量的變化

圖1 不同NaCl濃度處理下6種牧草的萌發率Figure 1 Germination rate of 6 pastures under different NaCl concentrations

表2 不同NaCl濃度處理下6種牧草丙二醛含量Table 2 MDA content of six grass species under NaCl treatment μmol·g-1

隨著NaCl脅迫強度的增加，各牧草葉片中的MDA含量均顯著升高 (P＜0.05)(表 2)。NaCl濃度在 0～100 mmol·L-1時牧草葉片中 MDA 含量變化幅度較小，說明牧草幼苗對低濃度NaCl脅迫有一定耐受能力；隨著NaCl脅迫的加劇，在150和200 mmol·L-1的NaCl濃度下，扁穗冰草和同德貧花鵝觀草(Roe gneria pauciflora Tongde)的 MDA含量增加較多，分別是對照的9.14、12.31倍和7.84、11.81倍；增加較少的是草原看麥娘和無芒雀麥，分別是對照的5.72、8.54倍和5.84、8.14倍。這表明扁穗冰草、同德貧花鵝觀草受到的傷害較大，草原看麥娘、無芒雀麥受到的傷害則較小。

2.2.2 6種禾本科牧草葉綠素含量的變化

隨著NaCl濃度的增大，6種禾本科牧草的葉綠素含量呈現先升后降的變化，同一物種在不同NaCl濃度下的葉綠素含量差異顯著 (P＜0.05)(表 3)。NaCl濃度為 50 mmol·L-1時，所有牧草的葉綠素含量均最高；NaCl濃度為 200 mmol·L-1時，所有牧草葉綠素含量較對照均顯著下降(P＜0.05)，同德貧花鵝觀草下降的最多，較對照下降了84.5%，葉綠素含量最少，受NaCl脅迫傷害大；而草原看麥娘下降最少，較對照下降了49.4%，受NaCl脅迫傷害?。煌露堂⑴麎A草和大穎草分別下降了60.7%和59.5%，耐鹽性居中間。

2.2.3 6種禾本科牧草可溶性糖含量的變化

6種禾本科牧草的可溶性糖含量呈先增加后降低的趨勢 (表 4)，NaCl濃度為 100 mmol·L-1時，所有牧草的可溶性糖含量均最高，150～200 mmol·L-1時可溶性糖含量下降，200 mmol·L-1時的可溶性糖含量最低。同一濃度下6種禾本科牧草間可溶性糖均值比較，無芒雀麥可溶性糖含量最高，顯著高于其他所有牧草(P＜0.05)；其次是草原看麥娘；同德貧花鵝觀草和扁穗冰草之間、同德短芒披堿草和大穎草之間差異不顯著(P ＞ 0.05)，但后兩種顯著高于前兩種牧草。

表3 NaCl處理下6種牧草葉綠素含量的變化Table 3 Changes of chlorophyll content of six grass species under NaCl treatment μg·g-1

表4 NaCl處理下 6 種牧草可溶性糖含量的變化Table 4 Changes of soluble sugar content of six grass species under NaCl treatment mmol·g-1

2.2.4 6種禾本科牧草脯氨酸含量的變化

隨著NaCl濃度的增加，6種禾本科牧草葉片中的脯氨酸含量也顯著增加(P＜0.05)(表5)。同一濃度不同物種間的脯氨酸均值，大穎草、扁穗冰草和同德短芒披堿草之間、草原看麥娘和無芒雀麥之間差異不顯著(P ＞ 0.05)，但后兩種顯著高于前3種。

2.2.5 6種禾本科牧草耐鹽性綜合評價

將參試的6種禾本科牧草與抗鹽性有關指標進行綜合分析，計算不同材料各指標隸屬度值，并以各材料的平均抗鹽隸屬度作為耐鹽鑒定綜合評價指標。結果顯示，6種牧草的耐鹽性強弱表現為，無芒雀麥＞草原看麥娘＞大穎草＞同德短芒披堿草＞扁穗冰草＞同德貧花鵝觀草(表6)。

3 討論

影響植物種子萌發和幼苗生長的重要因素是鹽[3]。羅志娜等[17]通過對燕麥(Avena sativa)種子的耐鹽性的研究，得出隨鹽脅迫的加劇，低鹽對種子萌發的影響極小，高鹽則對種子萌發的抑制作用很強[18]。也有研究[19]指出，鹽脅迫的濃度達到一定值時，增加的鹽濃度對植物的種子萌發和幼苗生長形成抑制效應。史燕山等[20]的研究表明，在低鹽下某些植物種子的萌發率顯著高于對照，而高鹽脅迫下，種子的萌發率顯著降低。本研究中只有扁穗冰草在 70 mmol·L-1濃度的 NaCl處理下種子的萌發率有一點升高，其他牧草相比對照呈下降趨勢，因此，高鹽脅迫對種子萌發有明顯的抑制作用，其抑制程度不同是由于不同物種對鹽的耐性不同所致。

表5 NaCl處理下 6 種牧草脯氨酸含量的變化Table 5 Changes of proline content of six grass species under NaCl treatment μg·g-1

表6 各牧草對NaCl處理適應指標的隸屬函數值及評價Table 6 Membership value and evaluation of adaptation indexes of herbage to NaCl treatment

MDA和脯氨酸是抗鹽脅迫的重要抗氧化劑。受鹽脅迫的牧草通過增加滲透調節物的含量，來維持正常的生理代謝，從而增加對鹽的抗性[21-22]。在本研究中，當NaCl濃度較低時，牧草能抵抗脅迫，但不同的牧草對鹽脅迫的敏感度不一樣，NaCl濃度的增加會破壞或傷害牧草的膜結構和功能，導致膜通透性增大，滲透調節物外滲，脂質化增強，影響幼苗生長。因此，牧草中MDA和脯氨酸的增加是牧草對鹽的耐受性增強的表現。本研究結果表明，扁穗冰草、同德貧花鵝觀草受鹽脅迫的傷害最大，草原看麥娘、無芒雀麥受鹽脅迫的傷害則最小，大穎草、同德短芒披堿草受鹽脅迫的傷害居中。

葉綠素不僅能吸收和傳遞光能，還是光合作用必不可少的原料，是植物光合能力的重要指標。在鹽堿脅迫下，葉片細胞的葉綠體結構被破壞，葉綠素含量在一定程度上降低并影響光合作用。大多數對于不同NaCl濃度對葉綠素含量的影響的研究發現NaCl脅迫顯著降低牧草中的葉綠素含量[23-25]。在本研究中，隨著NaCl濃度的增加，6種牧草的葉綠素含量先增加后降低，同一物種的葉綠素含量有顯著差異(P＜0.05)，呈現出低NaCl濃度處理促進葉綠素的合成，高NaCl濃度則抑制其合成，這與之前的研究一致[26]。這是因為鹽脅迫下高濃度的鹽分破壞細胞內的色素-蛋白-脂質復合體，降低葉綠素a和其他色素的含量，所以隨NaCl濃度的增加，呈現先增后減的趨勢。

可溶性糖是植物細胞的主要有機滲透調節因子，它直接反映了細胞遭受傷害的程度，其總含量也決定了植物對鹽脅迫的抗性[26]。本研究表明可溶性糖含量在 NaCl濃度為 100 mmol·L-1時最高，在 150～200 mmol·L-1下降，表明低鹽濃度促進牧草滲透調節力，而高鹽濃度已經使牧草受到鹽害。NaCl濃度為100 mmol·L-1也可作為本研究材料鹽脅迫的臨界值，可以為實踐應用提供理論依據。

本研究在室內對6種禾本科牧草做了鹽脅迫試驗，但還有待于到實際生態環境中去檢驗。在今后的研究中，建議能與實際環境條件和生產實際有機結合，則能更完整地說明6種牧草的抗鹽性，以及對不同NaCl濃度梯度的響應，從而選出真正需要的抗鹽型高寒牧草。

4 結論

本研究運用隸屬函數對6種禾本科牧草種子萌發及幼苗的耐鹽性進行綜合評價分析，得出各供試材料的耐鹽性強弱表現為無芒雀麥＞草原看麥娘＞ 大穎草＞同德短芒披堿草＞扁穗冰草＞同德貧花鵝觀草。