基于體外培養法研究不同GI指數的粗飼料與精飼料之間組合效應

楊洪明，王 宇，張軼鳳，李 晗，許宏楊，王向明，劉宇宸，楊曉明，齊智利

（1. 華中農業大學動物營養與飼料科學系，湖北 武漢 430070；2. 恩施市金欣農業發展有限公司，湖北 恩施 445033）

反芻動物生產主要依賴于牧草、農作物秸稈、酒糟等粗飼料[1-2]。在反芻動物日糧中，粗飼料通常占60%～70%，甚至更高，是瘤胃微生物和宿主動物重要營養來源。粗飼料的品質對反芻動物生產性能和健康有重要影響，并直接影響精料的供給量與成本，最終影響到生產者的效益。迄今，動物營養領域對粗飼料科學利用方面的研究還遠遠不夠[3]。在實際生產中，重精料不重視粗飼料科學利用的問題也相當普遍。隨著畜牧業生產經營方式的轉變，牛羊舍飼比例的增加，粗飼料在動物生產實踐中的地位就尤顯重要，如何提高粗飼料的采食量及消化率是粗飼料科學利用的重中之重，過去人們嘗試了各種方法來提高粗料尤其是秸稈的利用率，包括化學處理、物理處理、微生物處理及盲目的補飼[4]，但這不符合動物自身的生長規律及營養需要，同時大部分化學處理法對環境造成了極大的危害，這就背離了我們正大力提倡的綠色營養這一可持續發展戰略。

目前，國內外在粗飼料的利用上大多依靠加工調制，較少考慮動物自身存在的營養潛力及飼料間的組合效應。組合效應是指當不同粗飼料共同飼喂時，它們所提供的營養素就會發生互作，從而改變了隨后在動物體內的代謝過程。通過互作使日糧內某種利用率或采食量指標高于各個飼料相應指標的加權值，稱之為“正組合效應”；反之，低于各個飼料相應指標的加權值，則稱之為“負組合效應”[5]。越來越多的研究表明[6-7]，動物采食水平、日糧蛋白質補充料、易降解纖維、易發酵碳水化合物和脂肪的添加，以及飼料間的不同搭配組合、加工調制方法和一些營養調控措施等均會改變單個飼料的消化率和利用率，組合日糧的表觀消化率并不等于日糧中各飼料組分表觀消化率的加權平均值，不同飼料之間確實存在組合效應。

目前評定組合效應所用指標單一，尚沒有對瘤胃發酵產物進行過全面、綜合評價的方法，僅是以單純的補飼進行采食量和消化率等指標的測定。用人工瘤胃產氣法又局限于產氣量的研究或兩種指標(如將產氣量和微生物蛋白結合起來)的定性比較，評定結果差異很大。Blümmel等[8]曾將發酵殘留物與產氣量結合起來進行評定。但是由于之前報道所用指標少、片面，不能真實描述飼料間尤其是粗飼料間的組合效應。因此，張吉鹍[9]提出用多項指標綜合指數 (multiple-factors associative effects index, MFAEI)將人工瘤胃產氣法各時間點所測的各項指標綜合后來評定飼料間的組合效應。MFAEI的特點是動態性、綜合性、量化描述，可對飼料間組合效應進行整體量化，從而直觀地反映飼料間組合效應的大小。此外，盧德勛[10]根據我國粗飼料利用的現狀，以系統科學為指導思想，在廣泛吸取相對飼喂價值 (relative feed value, RFV)等粗飼料評定指數的優點的基礎上，結合我國粗飼料生產及利用的實際，適時地提出了評定粗飼料品質的粗飼料分級指數 (grading index, GI)。GI指數不僅可以對粗飼料品質進行合理分級、評定，而且為粗飼料科學搭配提供了一項新的技術手段。GI指數可充分發揮粗飼料營養素互補的生產潛力，從而提高粗飼料的利用率，優化動物生產[11]。本研究對反芻動物常用飼料[玉米(Zea mays)青貯、啤酒糟、羊草(Leymus chinensis)、稻秸及精料)采用體外(in vitro)培養法來探討粗飼料之間的組合效應及粗飼料與精料之間的組合效應，旨在為反芻動物的日糧配制和飼養實踐提供科學的理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 試驗用飼料

玉米青貯、羊草、啤酒糟和稻秸樣品采集于湖北省各奶牛場；樣品采集后，以四分法取樣。樣品在烘箱中65 ℃下烘干，剪成1 cm左右小段，粉碎，過孔徑0.425 mm篩以備進行化學成分分析和消化試驗，分別制樣100 g保存備用。

1.1.2 試驗用瘤胃液供體動物

選 5 只體況良好、體重相近 (20 ± 2) kg、安裝永久性瘤胃瘺管的健康馬頭山羊供采集瘤胃液用。試驗羊日糧配制參照NY/T 816-2004肉羊飼養標準[12]肉山羊飼養標準，基礎日糧組成和營養水平如表1所列。試驗羊單籠飼養，每天于06:00和18:00兩次飼喂，先喂精料，后喂粗料，自由飲水，常規光照、驅蟲與管理。

表1 試驗用瘤胃液供體羊基礎日糧的組成與營養水平Table 1 Composition and nutrient levels of sheep diet

1.2 試驗方法

1.2.1 單一粗飼料在瘤胃中動態發酵規律的研究

試驗采用單因素試驗設計，分別對4種粗料取樣0.5 g進行體外2、6、12和24 h培養，以確定單種粗料各個時間點pH、產氣量、干物質(dry matter,DM)消化率和中性洗滌纖維 (neutral detergent fiber,NDF)消化率。

主體為往復式恒溫水浴搖床，培養瓶瓶口安裝橡皮塞，用一次性注射器聯通，以保證培養瓶的厭氧狀態。注射器每次使用之前洗凈、晾干，然后用少量液體石蠟涂在活塞筒的四周，以防漏氣，而且可盡量減少氣體產生過程中活塞向上移動的阻力。用預熱39 ℃并通有CO2的保暖壺取用紗布過濾的瘤胃液，立即蓋緊密封，迅速送回實驗室。持續通入 CO25 min，按瘤胃液為 1∶2的比例充分混合后，配制成培養液，并快速分裝至每個培養管。分裝完畢后再向每個培養管充入CO2氣體1～2 min。在各試驗點培養結束后，記錄各個樣品的產氣量。然后取出培養瓶，測量培養液的pH。之后將溶液無損地轉移到尼龍袋中過濾。65 ℃烘干至恒重以測定其干物質含量。記錄各時間點的產氣量，當注射器刻度達到20 mL時排出氣體，使刻度回到5 mL的位置。用PHS-25型數顯酸度計數字酸度計測定pH，并測定DM和NDF消化率。

1.2.2 不同飼料之間的組合效應研究

根據前期試驗測定的數據，各個飼料GI指數由高到低依次是啤酒糟(11.02) 、玉米青貯(2.86) 、羊草(1.55) 和稻草(0.85)。綜合每種飼料的特點及這3種飼料在湖北省實際的搭配情況及GI指數，設計3種飼料組合，研究其組合效應，為反芻動物生產實踐提供科學依據和方法。

試驗采用單因素試驗設計，飼料按配方混合好后分別取樣 0.5 g進行體外 2、6、12和 24 h培養，以確定混合飼料各項體外指標(同試驗1.2.1)。

3種組合：1)玉米青貯和啤酒糟(高GI組合)；2)玉米青貯和羊草(高、低GI組合)；3)羊草和稻秸 (低 GI組合)(表 2)。

表2 不同飼料之間的組合比例Table 2 Combination of different feeds

1.2.3 精飼料與不同GI指數的混合粗飼料之間組合效應的研究

試驗采用單因素試驗設計，飼料按配方混合好后分別取樣 0.5 g進行體外 2、6、12和 24 h培養，以確定混合飼料各項體外指標。(同試驗1.2.1，混合比例同表2所列)。

1.2.4 組合效應計算方法

式中：SFAEI表示單項組合效應值，A1系單一粗料各個培養時間點各指標數值；A2為混合飼料各個培養時間點各指標數值；A3是在每個時間點A2總和的平均數。

MFAEI為各單項指標的加和值。

1.3 統計分析

本研究所有數據采用Excel 2007進行統計分析。

2 結果與分析

2.1 單一粗飼料發酵對瘤胃pH、瘤胃產氣量、干物質瘤胃消化率動態變化的影響

隨著發酵時間的延長，培養液的pH逐漸下降，當達到24 h時，下降趨勢趨于平穩。瘤胃培養液的產氣量呈逐漸增加趨勢(表3)。在24 h內，玉米青貯的產氣量最高，稻秸的產氣量最低；玉米青貯干物質消化率和NDF消化率明顯高于其他3種飼料，而且消化速度很快，其pH下降幅度卻明顯低于其他3種飼料，說明玉米青貯的干物質消化率和培養液pH有直接關系。

2.2 各單一粗飼料相加后的組合效應

3個組合都產生了正組合效應(表4)。從單項組合效應來看，產氣量產生的組合效應最為明顯。對于產氣量SFAEI來說，以羊草和稻秸組合最大，為0.40。pH產生的組合效應值最為微弱。從組合效應MFAEI來看，玉米青貯和啤酒糟最小，為0.29。玉米青貯和羊草組合以及羊草和稻秸組合綜合組合效應一樣，均為0.54。

2.3 粗飼料之間的組合效應

隨著培養時間的延長，培養液的pH逐漸下降，當達到24 h時趨勢趨于平穩(表5)。玉米青貯和啤酒糟組合pH下降幅度小于其他兩個組合，羊草和稻秸組合的pH下降幅度最大。

瘤胃培養液的產氣量逐漸增加。前期玉米青貯和羊草組合產氣量較多，速度較快。但玉米青貯和啤酒糟組合后期產氣速度加快，24 h產氣量反而最多。羊草和稻秸組合產氣量最小。

瘤胃培養液中混合飼料干物質消化率逐漸增加。粗粗組合干物質消化率和其產氣量的變化趨勢是一致的。玉米青貯和羊草組合，在前期消化較快，而玉米青貯和啤酒糟組合在后期消化速度加快，24 h消化率最高。羊草和稻秸組合消化率最低。飼料產氣量和飼料干物質消化率在趨勢上保持高度一致。

隨著飼料培養時間的延長，瘤胃中混合飼料的NDF消化率逐漸增加；玉米青貯和啤酒糟組合24 h消化率最高，0-12 h玉米青貯和羊草組合消化率增加速度最快，羊草和稻秸組合消化率最低(表5)。混合飼料的干物質消化率和NDF消化率的趨勢高度的一致。

2.4 粗精混合飼料發酵對瘤胃pH、瘤胃產氣量、干物質瘤胃消化率動態變化的影響

隨著培養時間的延長，瘤胃培養液的pH逐漸下降，當達到24 h時趨勢趨于平穩；玉米青貯、羊草和精料組合pH下降幅度最大，羊草、稻秸和精料組合pH幅度下降最??；在6-12 h這段時間，3組飼料pH變化幅度不大(表6)。瘤胃中的產氣量逐漸增加；玉米青貯、羊草和精料組合24 h產氣量最高，對比玉米青貯和羊草組合，加了精料后，產氣量明顯增加。

表3 單一粗料各個時間點pH、產氣量、干物質消化率、NDF消化率Table 3 pH value, gas production, dry matter digestibility, and NDF digestibility in single roughage at each point of time

表4 針對混合飼料“相加性”的組合效應Table 4 “Additive” combination effects of mixed feed

玉米青貯、啤酒糟和精料組合24 h干物質消化率最高。與沒加精料的組合相比，加了精料后，飼料發酵速度明顯加快。飼料產氣量和飼料干物質消化率在趨勢一致。

粗料和精料之間出現了明顯的組合效應(表6)。SFAEI以產氣量最為明顯，玉米青貯、羊草和精料組合最大，為0.30。pH的組合效應值最為微弱。

綜合組合效應值以羊草、稻秸和精料組合(MFAEI為0.37)及玉米青貯、羊草和精料組合(MFAEI為0.36)較大。這說明，精料的添加對粗飼料的發酵能力有很大的改善。特別對低GI指數組合羊草和稻秸組合的改善作用更大。對高GI指數組合玉米青貯和啤酒糟組合的改善能力較低GI指數組合要差。本部分試驗證明了粗精飼料之間有著明顯的正組合效應。單項組合效應值以產氣量最為明顯。pH值單項組合效應值最為微弱。精飼料的加入可以明顯改善反芻動物對粗飼料的利用情況。尤其對低GI指數組合羊草-稻秸組合的改善能力更強。

表5 粗粗組合各個時間點pH、產氣量、干物質消化率、NDF消化率Table 5 pH value, gas production, dry matter digestibility, and NDF digestibility in roughage-roughage combinations at each time point

表6 粗精組合各個時間點pH、產氣量、干物質消化率Table 6 pH, gas production, dry matter digestibility in roughage-concentrate combinations at each time point

3 討論與結論

3.1 關于產氣量、干物質消化率和NDF消化率之間關系

本研究中，產氣量和干物質消化率的趨勢保持高度的一致。吳躍明等[13]利用體外產氣技術研究了桑葉(Morus alba)與各種餅粕類飼料間的組合效應，發現用產氣量評定的結果同用消化率評定的結果在趨勢上高度一致，他認為可以直接用氣體產量評定飼料間的組合效應，這表明產氣量能在很大程度上反映飼料間的組合效應。此外，本研究還發現NDF消化率和干物質消化率的趨勢保持高度的一致。而這4種飼料的NDF含量(風干基礎)都很高，玉米青貯為77.11%，啤酒糟為63.21%，羊草為70.00%，稻草75.12%。張軼鳳等[7]研究發現，稻草、羊草、玉米青貯的干物質消化率與NDF的消化率有一致的趨勢變化，這與本研究的結果一致。所以可以推測，在NDF含量很高的飼料中，干物質消化率能夠反映出NDF的消化率。

3.2 關于pH組合效應的討論

本研究中，pH的組合效應都最為微弱，產氣量的組合效應值一般是pH效應值的10倍以上。王旭[14]、張吉鹍等[15]均報道在分析組合效應值時未考慮pH的組合效應，這與本研究的結果一致，因此在進行組合效應值時可以不予考慮pH的綜合效應值。但pH與瘤胃微生物的生物活性有著十分密切的關系，因此仍需要測定pH以及其變化趨勢，間接說明飼料的組合效應。

3.3 關于測定飼料組合效應的技術研究

當前評定飼料組合效應主要包括以下幾種技術：1)體內法：體內法要測定的是動物采食量、消化率和利用率，并以此評估飼料間的組合效應。但是體內法需要大量的飼料、動物并消耗大量的人力、物力、財力，限制它的使用。且動物差異性較大，導致試驗的可重復性差。2)半體內法：半體內法同樣由于動物和尼龍袋的差異導致可重復性差，限制了其使用范圍。3)體外消化法：即人工瘤胃產氣法，該方法簡單易行，重復性好、易于標準化，實行批量操作、測試。與半體內技術相比，產氣技術對動物依賴性小，對可溶性物質和小顆粒飼料有更精確的估測，且自動化程度高，減少了勞動力的投入。它同樣可獲得消化率和消化程度、揮發性降解產物量及微生物蛋白產生量。本研究采用的是人工瘤胃產氣法。將加入飼料的瘤胃培養液在體外培養24 h，測定飼料在不同時期的各個參數，能夠更加準確地分析各飼料之間的組合效應。

3.4 關于飼料組合效應評定指標的相關研究

現在評定粗飼料間組合效應的指標有多種。最常用的有采食量指標、消化率指標和利用率指標等。Blümmel等[8]曾建議將發酵殘留物與產氣量結合起來進行評定。由美國全國飼草測試協會(National Forage Testing Association)確認的粗飼料相對值，目前還在美國管理、生產、流通和交易等各個領域廣泛使用著，而我國至今尚缺乏這方面的技術。目前采用的技術指標少、片面，不能真實地描述飼料間尤其是粗飼料間的組合效應。

為此，盧德勛[16]在繼承RFV合理內涵的基礎上，提出了全新的粗飼料評定指數GI，除引入能量參數外，還引入了粗蛋白(crude protein, CP)與粗飼料干物質隨意采食量 (dry matter intake, DMI)等參數，首次將它們統一起來考慮，使其更具生物學意義。紅敏等[17]通過體外試驗比較新一代GI2008和GI，結果發現，GI2008與GI均能對粗飼料品質進行科學的評定。但在實際應用中，本研究所采用的GI指標簡便易行，更具有應用前景[18]。并且GI指數在反芻動物生產領域已經被廣泛推廣，取得了巨大的經濟效益[19-26]。所以，本研究采用的GI指數既體現了整體性，又反映了動態性與針對性，是一個集理論性與實踐性于一體的粗飼料品質評定、分級指數。

此外，楊志林等[27]提出用MFAEI將人工瘤胃產氣法各時間點所測的各項指標綜合后來評定飼料間的組合效應。MFAEI的特點是動態性、綜合性、可量化描述。本研究采用的MFAEI，通過測定pH、產氣量、干物質消化率、NDF消化率來評定組合效應的指標，可對飼料間組合效應進行整體量化，從而直觀地反映飼料間組合效應的大小。

4 結論

在本研究條件下，粗飼料之間、粗飼料與精飼料之間存在組合效應；粗飼料之間的組合效應以玉米青貯和羊草組合最為理想，MFAEI為1.40。精料的添加對粗飼料的發酵能力有很大的改善，特別是對低GI指數組合的羊草和稻秸組合的改善作用更大。

MFAEI能很好地量化飼料之間的組合效應，可直接進行組合效應的大小評定。飼料的產氣量和干物質消化率的趨勢保持高度一致，可以用產氣量來反映飼料間的組合效應。