蒺藜苜蓿PYL基因家族的全基因組鑒定、表達和功能分析

黃思源，呼天明，楊培志

（西北農林科技大學草業與草原學院，陜西 楊凌 712100）

截至目前，已經有許多植物鑒定到PYL家族基因，如在擬南芥(Arabidopsis thaliana)中鑒定到14個具有高度保守氨基酸序列的PYL基因[9]，在水稻(Oryza sativa)、葡萄(Vitis vinifera)、番茄(Lycopersicon esculentum)、 橡 膠 樹 (Hevea brasiliensis)和 棉 花(Anemone vitifolia)中分別鑒定到 12、8、14、21和27個PYL基因[10-14]，其中一些PYL基因的功能已經被成功驗證，如擬南芥AtPYL4過表達可以增強擬南芥的耐旱性[15]，AtPYL8與AtPYL9在擬南芥側根生長中起重要作用[16]，玉米(Zea mays) ZmPYL8、ZmPYL9和ZmPYL12的過表達可以增強玉米的耐寒性[17]，水稻OsPYL5的過表達可以增強水稻對干旱和鹽脅迫耐性[18]。目前，蒺藜苜蓿全基因組測序已經完成[19]，這為用生物信息學手段研究該物種基因家族系統演化及功能分析奠定了基礎，而PYL基因在增強非生物脅迫下的耐受性方面發揮重要作用。因此，鑒定和驗證蒺藜苜蓿中的PYL基因對理解它們的功能和ABA信號轉導途徑具有非常重要的作用。

本研究利用生物信息學的方法鑒定蒺藜苜蓿中PYL基因家族成員，并分析其基因結構、蛋白結構域、保守基序等信息，同時檢測該基因家族成員在干旱脅迫下的表達模式，旨在為蒺藜苜蓿PYL基因的克隆及功能研究提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 植物材料和處理

用次氯酸鈉將蒺藜苜蓿種子消毒5 min后用蒸餾水沖洗干凈，將處理后的種子放入濾紙覆蓋的培養皿中，放入人工培養箱，在25 ℃/15 ℃(白天/黑夜)進行暗培養，暗培養5 d后，將幼苗移栽到裝有石英砂的塑料培養缽 (9 cm × 27 cm)中進一步培養[20]，培養30 d后，將蒺藜苜蓿根部從石英砂中洗出，放置在新的具有干石英砂的塑料培養缽中進行干旱脅迫[21]。采集干旱脅迫0(CK)、3、8 h的蒺藜苜蓿葉片，收集樣品后立即在液氮中冷凍，儲存在-80 ℃冰箱中以備之后進行RNA提取。

1.2 蒺藜苜蓿PYL基因家族的全基因組鑒定與染色體定位

以擬南芥的14個PYL蛋白序列作為查詢序列，在NCBI網站(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/ncbisearch/)通過蛋白質基本局部比對工具設置BLASTp[22]搜索蒺藜苜蓿全基因組，設置檢索閾值E-value為e-6，同時，在Pfam數據庫(http://pfam.xfam.org/browse)中下載了Polyketide_cyc2結構域的HMM文件(PF10604)，并利用 HMMER V3.1b2(http://www.hmmer.org)軟件構建隱馬爾科夫模型(HMM)，在蒺藜苜蓿蛋白數據庫搜索含有Polyketide_cyc2結構域的序列，人工去除冗余基因，并通過NCBI-CDD數據庫[23](https://www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd/)鑒定候選的序列是否具有PYR_PYL_RCAR_like結構域(cd07821)，根據染色體的位置對包括PYR/PYL/RCAR功能域的候選基因進行命名。在蒺藜苜蓿基因組瀏覽器(http://www.medicagohapmap.org/fgb2/gbrowse/mt40/)中鑒定基因序列和位置。在ExPASy[24]網站(http://web.expasy.org/)上鑒定氨基酸數目及等電點(pI)和分子量(MW)。通過YLoc網站[25](http://abi.inf.uni-tuebingen.de/Services/YLoc/webloc.cgi)對候選基因進行亞細胞定位預測。使用MapInspect軟件[26]對基因在染色體的分布進行定位，利用MCScanx[27]進行基因家族的復制分析，判定基因復制事件。

1.3 蒺藜苜蓿 PYL基因家族的系統進化樹分析

使用蒺藜苜蓿、水稻和擬南芥PYL基因的蛋白質序列構建系統發育樹。使用MEGA 6.0[28]軟件對蛋白質序列進行序列比對，通過鄰接(NJ)法構建系統發育樹，設定bootstrap值等于1 000。最后將構建好的樹形圖文件上傳到ITOL[29]網站(http://itol.embl.de/)進行美化，以更好地展示。

1.4 基因外顯子-內含子結構和蛋白質保守基序分析

使用TBtools軟件比較蒺藜苜蓿PYL基因的CDS序列和基因組序列，分析基因外顯子-內含子結構。在MEMEsuite網站[30](http://meme-suite.org/)對候選的蒺藜苜蓿PYL基因鑒定保守基序，設定8個基序的限制。

1.5 MtPYL啟動子中的順式元件分析

從 Ensemble plants網站 (http://plants.ensembl.org/index.html)數據庫獲得蒺藜苜蓿PYL基因起始密碼子(ATG)上游1 500堿基對(bp)內的序列，使用PlantCARE數據庫(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)搜索啟動子中的順式元件[31]。

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1.6 靶向 MtPYL基因的 miRNA 的預測

在PSRNATarget網站[32](http://plantgrn.noble.org/psRNATarget/)預測潛在的miRNA，采用默認參數。對預測結果使用Cytoscape軟件[33](http://www.cytoscape.org/)進行展示。

1.7 基因表達譜和基因本體富集分析

從蒺藜苜蓿基因表達圖譜(MtgeA)Web服務器[34](http://mtgea.noble.org/v2/)下載蒺藜苜蓿不同組織及鹽脅迫下的PYL基因的表達數據，獲取的表達數據用R語言程序包pheatmap繪制熱圖，使用R語言程序包clusterProfiler[35]進行基因本體(GO)分析及KEGG通路分析，對基因進行功能注釋。

1.8 RNA 提取和實時 qRT-PCR

使用Eastep TM總RNA提取試劑盒(北京普洛麥格生物技術有限公司)從干旱的樣品中提取RNA。使用 1 μg RNA 模板樣品，使用 HiScript II Q Select RT SuperMix for qPCR 試劑盒 (南京諾維贊生物科技有限公司)合成互補DNA的第一鏈(cDNA)。使用LightCycler? 480 II實時熒光定量 PCR 儀進行 qRTPCR測定。

2 結果與分析

2.1 MtPYL基因的全基因組鑒定

根據擬南芥PYL蛋白序列對蒺藜苜蓿基因組進行BLASTp搜索，為了進一步證實這些候選序列的可靠性，通過Pfam數據庫鑒定序列存在Polyketide_cyc2結構域(PF10604)，并通過NCBI-CDD數據庫鑒定序列存在PYR_PYL_RCAR_like結構域(cd07821)。最終在蒺藜苜蓿基因組中鑒定到14種PYL基因家族成員(表1)。根據其在染色體上的位置(表1)，14個成員被命名為MtPYL1-14。

基因在染色體上的分布顯示，14個PYL基因家族成員分布在除2號染色體外的其他7條染色體上，其中在第1、3、5號染色體上分布較多，各有3個PYL基因(圖1)。物理化學分析表明，14個PYL基因家族成員氨基酸的長度在168～233個氨基酸(aa)范圍內，相應的蛋白質分子量在18.5～25.4 kDa，等電點 (PI)在 4.45～7.64。根據 YLoc網站對PYL蛋白亞細胞定位的預測表明，PYL蛋白主要定位在細胞質中。

2.2 蒺藜苜蓿 PYL基因的系統發育分析和分類

為了確定蒺藜苜蓿PYL基因的進化關系并對它們的分類，對蒺藜苜蓿、擬南芥和水稻的PYL基因進行進化分析，使用MEGA軟件產生無根的NJ樹。

這3個物種的共40個PYL基因被聚為4組(圖2)。對每組中不同物種的PYL基因的數目進行統計，結果表明，14個蒺藜苜蓿的PYL基因被聚類到所有的組1～4中，每組分別包含4、2、3和5個蒺藜苜蓿PYL基因，擬南芥14個PYL基因被聚類到組1～3中，分別包含3、9和2個基因。水稻的12個PYL基因同樣也是分布到組1～3中，分別包含3、3和6個基因，值得注意的是，組4中的5個基因全部為蒺藜苜蓿PYL基因，根據進化樹發現，蒺藜苜蓿和擬南芥之間存在幾個密切相關的PYL基因，比如 AtPYL4與 MtPYL13，AtPYL2與MtPYL1等，這暗示它們之間可能具有相似的功能。

表1 蒺藜苜蓿PYL基因家族成員基因組信息和蛋白特征分析Table 1 Analysis of genomic information and characterization of protein encoded by PYL gene family members in Medicago truncatula

圖1 蒺藜苜蓿 PYL 基因的染色體定位Figure 1 Chromosomal mapping of PYL genes in M. truncatula

圖2 3 個植物物種 PYL 蛋白的進化關系Figure 2 Phylogenetic relationship among the PYL proteins of the three plant species

圖3 蒺藜苜蓿基因的外顯子－內含子結構及功能域信息Figure 3 Exon-intron structures and domain information of PYL genes in M. truncatula

2.3 蒺藜苜蓿 PYL基因的結構與功能域分析

功能域預測結果顯示(圖3)，PYR_PYL_RCAR_like結構域存在于所有的14個蒺藜苜蓿PYL基因中，基因外顯子-內含子結構結果(圖3)顯示，蒺藜苜蓿PYL基因的基因結構大多只含有一個外顯子，只有MtPYL2、MtPYL5、MtPYL14具有3個外顯子。結合進化樹，14個蒺藜苜蓿MtPYL基因中，其中10個只有1個外顯子的基因分布于組1，組2和組4中(圖2)，其中，組1和組2的成員全部只有1個外顯子，具有3個外顯子的MtPYL2、MtPYL5、MtPYL14全部落入組3中，而具有兩個外顯子的MtPYL9則落入組4中。而且具有相似外顯子-內含子組織的基因大部分落入同一組中，這進一步支持了本研究中蒺藜苜蓿PYL基因的分類。

2.4 保守基序的分析

使用MEME程序鑒定蒺藜苜蓿PYL基因蛋白質的保守基序，并且通過Smart數據庫進一步預測它們的序列和注釋。結果顯示，在大多數蒺藜苜蓿PYL基因蛋白中鑒定出3個保守的基序(表2、圖4)。保守基序的長度在41～50個氨基酸范圍內，Polyketide_cyc2結構域在蒺藜苜蓿PYL蛋白的保守基序1、2、4、5中被預測(表2)。保守基序1、2在 MtPYL1、MtPYL2、MtPYL4、MtPYL5、MtPYL7、MtPYL8、 MtPYL9、 MtPYL10、 MtPYL13、 MtPYL14中高度保守，保守基序4、5在MtPYL3、MtPYL6、MtPYL11、MtPYL12中高度保守，而MtPYL9只包含保守基序5(圖4)。

表2 蒺藜苜蓿PYL蛋白15中不同的保守基序Table 2 Fifteen different motifs commonly observed in PYL proteins of M. truncatula

圖4 蒺藜苜蓿 PYL 蛋白的保守 motif分布Figure 4 Distribution of conserved motifs of PYL proteins in M. truncatula

2.5 家族內部基因的重復事件分析

分析蒺藜苜蓿PYL基因的重復事件結果顯示(表 3、 圖 5)， MtPYL4-MtPYL10， MtPYL5-MtPYL2，MtPYL2-MtPYL4，MtPYL7-MtPYL13的這4對基因表現為在共線性區域的共線性基因。MtPYL1，MtPYL3，MtPYL6，MtPYL8，MtPYL9表現為散在重復序列，MtPYL11，MtPYL9表現為染色體附近的重復(不相鄰)，未發現串聯重復基因(圖5、表3)。

表3 蒺藜苜蓿 PYL 基因重復時間分析Table 3 Analysis of gene duplication time of PYL gene family members in M. truncatula

圖5 蒺藜苜蓿PYL基因在共線性區域的共線性基因Figure 5 WGD/segmental analysis of PYL gene family members in M. truncatula

2.6 miRNA 分析

近年來，越來越多的人開始關注miRNA與mRNA之間的相互作用，已有研究表明，miRNA主要通過調節與植物脅迫相關的基因表達來應對外界脅迫。為了解參與蒺藜苜蓿PYL基因調控的miRNA，使用PStarget網站預測出了90個靶向14個蒺藜苜蓿PYL基因的miRNA，并構建了一個關系網絡。分析調控網絡的連接分布，發現MtPYL1和MtPYL5是成功靶向性最強的蒺藜苜蓿PYL基因，miR2630家族的26個家族成員都靶向MtPYL1和MtPYL5。除此之外，mtr-miR5248被鑒定為靶向兩種蒺藜苜蓿PYL基因(MtPYL11，MtPYL12)，mtr-miR2612被鑒定為靶向4種蒺藜苜蓿PYL基因(MtPYL1、MtPYL4、MtPYL7 和 MtPYL13)(圖 6)。

2.7 順式作用元件分析

順式原件分析結果表明，在蒺藜苜蓿PYL啟動子中鑒定到26種已知的與脅迫和激素相關的順式作用元件。其中 HSE、MBS、TC-rich repeat、LTR、ARE和Box-W1是分別涉及植物對熱、干旱、防御脅迫、低溫、厭氧和真菌誘導反應的原件。分析結果顯示，所有的14種蒺藜苜蓿PYL基因的啟動子序列中至少包含3種參與與應激反應有關的順式元件(圖7)，這表明蒺藜苜蓿PYL基因可能在應對各種脅迫中發揮重要作用。除此之外，14種蒺藜苜蓿PYL基因的啟動子序列中還包含有0～4種類型的與激素響應有關的順式元件，其中12個基因具有至少1個以上的與激素響應有關的順式元件，包括生長素應答元件(TGA-element)、脫落酸響應元件(AuxRR-core)、乙烯響應元件(ABRE)、赤霉素反應元件(ERE)、水楊酸響應元件(P-box和TCA-element)，這表明蒺藜苜蓿PYL基因可能在對激素的響應中也發揮重要作用。

2.8 基因本體論 (GO)分析及 PATHWAY 分析

對蒺藜苜蓿PYL基因進行GO分析顯示，14個蒺藜苜蓿PYL基因在細胞成分(CC)類別的細胞質(GO:0005737)中富集，在分子功能(MF)類別的受體活性(GO:0004872)富集。在生物過程(BP)類別的脫落酸激活信號通路(GO:0009738)、信號傳導(GO:0007165)和對外界壓力的響應(GO:0006950)中富集。而KEGG通路分析顯示，蒺藜苜蓿PYL基因主要參與植物激素信號轉導。

圖6 蒺藜苜蓿 PYL 基因與 miRNA 的關系網絡Figure 6 Regulatory network relationships between the putative miRNAs and their targeted MtPYL genes

The green circle is the MtPYLs, the purple circle is the miRNA with the expected 5 expectation, and the red circle is the miRNA with the expected 4 expectation. The smaller the expected value is, the higher the prediction accuracy is.

圖7 蒺藜苜蓿 PYL 基因順式原件分析Figure 7 Cis-acting elements in the promoters of each MtPYL gene

2.9 基因表達模式分析

利用蒺藜苜蓿 M. truncatula Gene Expression Atlas(MtGEA)Web服務器進行的組織表達分析結果表明，14個蒺藜苜蓿PYL基因在數據庫中都有表達數據。聚類圖中用紅－白－藍三色代表基因表達量的多少，紅色色度越高代表基因表達量高，藍色色度越高代表基因表達量越低。結果顯示，MtPYL10與MtPYL14在根中特異性表達，MtPYL4在根中表達量最高，MtPYL1、MtPYL2、MtPYL5、MtPYL6、MtPYL11與MtPYL13在植物的各個組織都普遍表達，MtPYL3、MtPYL8、MtPYL9、MtPYL12 在植株的各個部位表達量都普遍偏低(圖8A)。除此之外，我們還檢測了鹽脅迫下根發育過程中蒺藜苜蓿PYL基因的表達數據，結果表明，在鹽脅迫下，表達量上調的基因有MtPYL12、MtPYL2和MtPYL5，表達量下調的基因有MtPYL14、MtPYL11、MtPYL13和MtPYL10。

圖8 蒺藜苜蓿PYL基因家族在不同組織中的表達量熱圖(A)和在干旱脅迫下的表達量熱圖(B)Figure 8 Heatmap showing members of PYL gene family in different tissues (A) and expression heatmap under drought stress (B)

2.10 RT-PCR 驗證

通 過 蒺 藜 苜 蓿 M. truncatula Gene Expression Atlas(MtGEA)Web服務器上的表達數據選擇在苜蓿不同部位都有明顯表達的MTRPYL1、MTRPYL6、MTRPYL10、 MTRPYL11、 MTRPYL12、 MTRPYL13、MTRPYL14以及在不同鹽濃度脅迫下具有響應模式的編輯MTRPYL2和MTRPYL5進行輕度干旱(3 h)與重度干旱(8 h)脅迫處理下RT-PCR，檢測基因表達模式。結果顯示，在輕度脅迫下大部分基因表現出顯著下調的趨勢(圖8B)，只有MTRPYL5和MTRPYL6基因表達量顯著上調(P＜0.05)，重度干旱脅迫下大部分基因仍表現出顯著的下調趨勢，只有 MTRPYL2和 MTRPYL12顯著上調 (P ＜0.05)，特別是MTRPYL12上調倍數達5.3倍(圖9)，與蒺藜苜蓿MtGEA Web服務器上的數據表達模式基本類似。

3 討論

圖9 干旱脅迫處理后苜蓿PYL基因家族基因的相對表達量Figure 9 Relative expression of members of MtPYL gene family under drought stresses

植物激素ABA以植物生長和發育的調節以及對非生物和生物脅迫的響應兩個功能而聞名[36]。作為ABA受體的PYL是下游ABA信號的第一步[37]，并且是ABA信號轉導途徑中的重要元件。PYL基因家族在許多植物中已鑒定分離出來，本研究是首次鑒定到蒺藜苜蓿中的PYL基因。本研究在蒺藜苜蓿全基因組中鑒定出14個MtPYL基因，與擬南芥中的成員數量相同，多于水稻基因組中PYL的數量(12個)。通過復制事件分析發現，蒺藜苜蓿PYL基因家族成員中存在共線性區域的共線性基因，散在重復序列，染色體附近的重復(不相鄰)，未發現串聯重復基因，推測這可能對蒺藜苜蓿PYL基因家族的擴展具有重要作用。此外，14個PYL蛋白具有不同的蛋白相對分子質量和不同的等電點，表明它們可能在不同的微環境中發揮其功能。

通過系統進化和基因結構等分析，蒺藜苜蓿PYL基因可被劃分為4組，這種分類符合之前對擬南芥、水稻、歐洲油菜(Brassica napus)和短柄草(B. sylvaticum)中PYL的系統發育分析[38]，其中3組中既有擬南芥的PYL基因家族成員，又有水稻的PYL基因家族成員，表明蒺藜苜蓿和擬南芥與水稻之間可能具有類似的進化軌跡。其中同源性較高的基因可能具有相似的功能，例如AtPYL8與MtrPYL12、MtrPYL15具有較高同源性，而AtPYL8基因與植物的側根發育相關，推測MtrPYL12、MtrPYL15基因也可能與植物的側根生長相關。但蒺藜苜蓿PYL基因在進化上又表現出差異性，暗示了其基因功能的多樣性。通過保守基序分析鑒定出4個保守的基序，保守基序的長度在41～50個氨基酸范圍內，大多數蒺藜苜蓿PYL基因包含兩個保守基序，結合進化樹分析，同一組的蒺藜苜蓿PYL基因具有非常相似的保守基序，這表明蒺藜苜蓿PYL基因具有高度保守的蛋白質結構。亞細胞定位預測顯示蒺藜苜蓿PYL基因主要在細胞質上，這與擬南芥、水稻植物一致[6]，這表明，PYL的功能在不同的植物種類中是保守的。通過GO與KEGG分析發現，14個蒺藜苜蓿PYL基因在脫落酸激活信號通路、信號傳導和對外界壓力的響應的過程中高度富集，這表明PYL基因在多個生物學過程中發揮著重要作用。

PYL基因家族作為ABA的受體，參與多種與ABA有關的生理反應，其中AtPYL4、AtPYL8、AtPYL9、 ZmPYL8、 ZmPYL9、 ZmPYL12 和 OsPYL5已經被相關試驗成功驗證。在本研究中，大部分蒺藜苜蓿PYL基因在根、莖、葉片、葉柄、花、莢果和種子等不同組織中廣泛表達，表明它們可能參與多種生理反應，其中鹽脅迫下蒺藜苜蓿PYL基因在根中的表達量與非脅迫條件下有明顯差異，表明蒺藜苜蓿PYL基因可能參與鹽脅迫反應。此外，啟動子順式原件分析顯示在蒺藜苜蓿PYL基因啟動子中檢測到許多與脅迫有關的順式元件，表明蒺藜苜蓿PYL基因的表達可由不同的脅迫誘導。通過RT-PCR分析發現，只有MTR_PYL5、MTR_PYL6、MTR_PYL2與 MTR_PYL12這 4種基因在干旱條件下顯著上調(P＜0.05)，而大部分基因在受到干旱脅迫時下調表達，推測這可是負反饋調節機制[39]：當干旱脅迫下大量ABA在葉片中累積時，PYL表達可能被抑制，這進一步表明它們可能參與植物對干旱脅迫的響應過程。

4 結論

本研究在蒺藜苜蓿基因組中鑒定出14個PYL基因家族成員；通過對蒺藜苜蓿PYL基因進行基因結構、進化關系、保守基序和順式原件等分析表明，蒺藜苜蓿PYL基因在植物應對非生物脅迫過程中具有重要作用；qRT-PCR分析結果也表明，蒺藜苜蓿PYL基因在干旱脅迫下具有明顯的表達模式。總之，蒺藜苜蓿PYL基因家族作為ABA受體在蒺藜苜蓿抵抗逆境脅迫過程中是有作用的，但各成員的具體功能需要后續試驗進一步驗證。