轉錄組學在牧草上的應用進展

王 飛，劉林波，高天歌，高 鯉，包愛科，王鎖民

（蘭州大學草地農業生態系統國家重點實驗室 / 蘭州大學農業農村部草牧業創新重點實驗室 /蘭州大學草地農業科技學院, 甘肅 蘭州 730020）

轉錄組(transcriptome)是在某一生理條件下，生物體細胞內特定組織或器官轉錄出來的所有RNA產物的集合，包括mRNA、rRNA、tRNA以及非編碼RNA[1-2]。轉錄組學(transcriptomics)適用于在整體水平上研究細胞中基因轉錄情況及調控規律，包括非編碼區域功能研究、轉錄本結構研究、基因轉錄水平研究和全新轉錄區域研究[3]。轉錄組測序即RNA測序(RNA-Seq)，指利用高通量測序技術進行cDNA測序(RNA-seq)[2]。相較于傳統的基因芯片測序[4]，RNA-Seq可全面并準確地測定出多細胞生物整體轉錄活動，已被應用于生物學研究及醫藥研究的多個領域。在植物方面，隨著測序技術的發展，轉錄組測序在玉米(Zea mays)[5-8]、小麥(Triticum aestivum)[9-12]、水稻(Oryza sativa)[13-15]以及大豆(Glycine max)[16-18]等作物研究中已有廣泛的應用。牧草是供牲畜飼用的草或其他草本植物，是畜牧業能夠快速穩定發展的基礎。近年來，轉錄組測序在牧草種質資源評價、重要性狀形成機制以及優異基因資源挖掘、分子標記開發等方面已開始應用，并取得了一系列重要進展。本研究從高通量測序技術的發展及轉錄組測序在牧草生長發育、生物脅迫適應機制、非生物脅迫(鹽堿、極端溫度、干旱、營養虧缺、重金屬等)適應機理、逆境轉錄因子挖掘和分子標記開發等方面對相關研究進行綜述，以期為牧草種質資源的開發與利用、優異基因的挖掘和牧草分子育種提供一定的依據。

1 高通量測序技術的發展

高通量測序技術又稱深度測序(deep sequencing)技術，包括第二代測序技術(new sequencing technologies)[19]和單分子測序技術，可以同時對上百萬個DNA分子進行測序，使得對一個物種的基因組和轉錄組的全面分析成為可能，是測序技術發展史上的一個重要里程碑。

1.1 第二代測序技術

隨著人類基因組測序工程及模式生物基因組測序的完成，重測序技術開始被應用。傳統的測序已經不能完全滿足研究的需要，因此出現了費用更低、通量更高、速度更快的測序技術，被稱為“第二代測序技術”。第二代測序技術包括Roche/454[20]、Illumina[21]、美國應用生物系統公司的SOLiD[22]與HelicosHeliScope[23]。四大測序平臺各有其優缺點：Roche/454的測序原理為焦磷酸合成測序，平均讀長 400 bp，數據量 0.5 Gb·run-1，準確率 ≥ 99%，讀長最長，運行速度快，但試劑花費高且同源重復序列出錯率較高[24-26]；Illumina的測序原理為可逆染料終結合成測序，平均讀長100 bp，數據量54～60 Gb·run-1，準確率 98%～99%，性價比高，是目前應用最廣泛的平臺，但讀長短[25-27]；SOLiD的測序原理為連接測序，平均讀長50 bp，數據量100 Gb·run-1，準確率 ≥ 99.94%，準確率最高但是讀長短 、 運 行 時 間 長[25-26, 28]； Helicos HeliScope 的 測 序原理為單分子合成測序，平均讀長35 bp，數據量21～35 Gb·run-1，準確率 97%～99.8%，產量高、文庫制備簡單，不需要DNA擴增或連接，但失誤率高[25-26, 29]。二代測序技術的到來極大地減少了測序成本、降低了試驗的復雜性，同時提高了轉錄本的覆蓋度，使得基于轉錄組分析測序在科學研究中更加可行和有用，其已被廣泛應用于新基因的發掘、標記基因的開發、轉錄圖譜的繪制和生物代謝途徑的確定等諸多領域。

1.2 單分子測序技術

雖然第二代測序技術已被應用到科學研究的多個領域，但也存在著許多的不足。如，測序讀長較短[30]，擴增后得到的DNA分子片段的數目與擴增前相比有相對偏差[31]，這些缺點在一定程度上限制了第二代測序技術的應用和發展。隨著測序技術的進一步發展，出現了第三代測序技術。第三代測序技術即單分子測序技術，采用分子讀取技術，讀取數據速度更快的同時不需要PCR擴增步驟，從而降低了測序的成本，其測序平臺主要有Helicos biosciences 公司的 tSMSTM(true single molecular sequencing)技術平臺、美國 Pacific Biosciences 公司的 SMRT(single molecule real-time)技術平臺、美國Life Technologies 公司的基于 FRET 測序技術以及美國 Ion Torrent 公司與英國 Oxford NanoporeNechnologies公司的納米孔單分子技術[32-33]。由于第三代測序技術相比于第二代測序技術具有更高的通量、相對便宜的測序儀器和試劑以及更加簡單的操作，已被應用于基因組測序、突變鑒定、RNA測序、重復序列和PolyA結構的測序及醫學領域。

2 轉錄組測序在牧草生長發育研究中的應用

植物的生長發育是一個極其復雜的過程，在各種物質代謝的基礎上表現為種子萌發、營養生長、生殖生長以及植物體的死亡。對牧草而言，牧草產量和營養品質與植物的生長發育是密不可分的。要獲得高產、營養品質優良的牧草，最有效的途徑之一就是從牧草的生長發育研究入手，挖掘它們自身中與各種代謝途徑密切相關的基因，并利用這些基因對牧草進行遺傳改良。目前，轉錄組測序在牧草生長發育機制研究中已得到了廣泛的應用。

Zhang等[34-35]測定了兩個不同品種(休眠和非休眠性)紫花苜蓿(Medicago sativa)在不同時間點的轉錄組，分析得到了與紫花苜蓿秋眠性相關的一些基因，為解析苜蓿的秋眠性機理提供了一定的參考。Martin等[36-37]對C4模式植物狗尾草(Setaria viridis)分生組織、細胞過渡、擴張和成熟區分別進行了轉錄組測序分析，得到了其完整的基因表達和代謝產物圖譜，同時他們還通過對狗尾草莖節間的RNA-seq測序分析，為探究狗尾草生長發育過程中莖節間細胞壁沉積的基本生理與分子機制提供了依據。張曼[38]運用轉錄組測序技術測定了在超高濃度CO2中生長的狗尾草葉片，并同正常條件下生長的狗尾草轉錄組數據進行比較分析，篩選得到了參與糖代謝、光合作用、氧化還原反應和脅迫刺激反應等生物學過程的174個差異基因，此結果為解讀C4植物響應超高濃度CO2的分子機制提供了幫助。這些研究有助于從分子水平上對牧草的生長發育進行認識，并可通過這些差異基因對牧草進行遺傳改良。

3 轉錄組測序技術在牧草抗逆機制研究中的應用

環境因子和病蟲害等嚴重影響牧草的正常生長發育和產量。研究植物抗逆機制并利用基因工程的方法培育抗逆植株具有重要意義。目前，轉錄組測序在牧草抗逆機制研究中已得到了廣泛的應用(表1)，以下將對相關研究進行綜述。

表1 已應用轉錄組測序研究抗逆機制的牧草種類Table 1 Species of forage that have studied the mechanism of stress resistance by transcriptome sequencing

3.1 牧草對生物脅迫的適應機制

與其他植物一樣，牧草遭受到病原微生物的侵害后會發生新陳代謝紊亂，進而影響其生長發育、產量與品質。當前，通過高通量測序技術，從牧草轉錄組中篩選與抗病原微生物侵入相關的基因并利用分子生物技術進行遺傳控制，已成為防治牧草病害的有效途徑之一。Wichmann等[39]對被半透明黃單胞菌(Xanthomonas translucens)侵染的抗細菌性枯萎病(bacterial wilt)和易感病的兩種意大利黑麥草(Lolium perenne)在不同時間點的轉錄組進行了分析比較，發現被病菌侵染后，抗病型意大利黑麥草中有一些基因的表達量發生了變化，說明它們可能與意大利黑麥草抗細菌性枯萎病有關，此研究結果有助于黑麥草分子標記輔助抗病育種相關工具的開發與利用。褐斑病(brown spot)是由立枯絲核菌(Rhizoctonia solani)引起的一種真菌病害，Zhu等[40]通過轉錄組測序分析研究了立枯絲核菌AG1侵染結縷草(Zoysia japonica)栽培種“Zenith”根部后兩者之間存在的早期相互作用，揭示了立枯絲核菌與結縷草在侵染初期兩者相互作用過程中的表達譜，此研究對立枯絲核菌AG1-IA 關鍵致病性的鑒別起到了很大的幫助。

過度放牧導致牧草產量下降甚至植物死亡，易引起草原植被破壞和沙漠化，嚴重阻礙了畜牧業的發展。如何提高牧草的耐牧能力，最大限度的提高牧草效益，是畜牧業亟待解決的問題之一。Liu等[41]利用RNA-seq測序技術分別測定了用牛唾液處理4、8和24 h后紫花苜蓿葉片的轉錄組數據，共得到4 814個差異表達基因，通過聚類、GO以及KEGG富集鑒定并分析這些基因發現它們在響應唾液沉積中起到了潛在的作用，并且這些基因的表達量在“亞油酸代謝”、“植物-病原體相互作用”、“a-亞麻酸代謝”、“植物激素信號傳導”和“核糖體”通路中都有明顯的增加，此研究不僅可以加深對苜蓿與唾液沉積之間復雜相互作用的理解，而且還將有助于了解植物對草食動物放牧的響應機制，以及利用育種手段對牧草進行遺傳改良提供了潛在的目標。石紅霄[42]采用HiSeqTM 2500高通量測序技術分別對高原早熟禾(Poa alpigena)矮化和正常植株進行了轉錄組測序分析，篩選得到了在放牧條件下的高原早熟禾體內與光合作用途徑、葉綠體光合代謝途徑、氧化磷酸化途徑、蛋白酶、過氧化物酶、脂肪降解以及Notch 信號途徑等富集差異通路相關的差異基因，并且發現這些功能差異基因與高原早熟禾適應放牧脅迫的能力密切相關。這為利用分子手段改善牧草的耐放牧能力提供了一定的借鑒。

綜上所述，轉錄組測序在牧草抗病性和耐牧性上已有應用，但在抗蟲害和鼠害等方面應用甚少。隨著測序技術的不斷發展，通過轉錄組測序分析，篩選出一些與牧草抗病蟲害等生物脅迫相關的基因，并利用分子手段通過這些關鍵基因對植物進行遺傳改良，是提高牧草產量和品質的有效途徑之一。

3.2 牧草對非生物脅迫的適應機理

各種非生物脅迫因子影響牧草的正常生長，造成草產量下降、牧草品質降低，甚至植物的死亡。目前，高通量測序技術在研究牧草適應非生物脅迫上已得到了廣泛的應用。通過轉錄組數據分析，可篩選得到與植物適應非生物脅迫相關的關鍵基因，并利用其對抗性差的品質進行遺傳改良，從而有效提高牧草適應非生物脅迫的能力。轉錄組測序在牧草適應非生物脅迫方面的研究主要集中在植物耐鹽堿、耐極端溫度、抗旱、營養元素虧缺及重金屬毒害抗性等方面。

3.2.1 抗鹽堿機制

鹽堿會影響牧草苗期及生長期的正常生長發育，造成植物體內養分吸收、利用和分配的不平衡，并產生離子毒害作用[43]。轉錄組測序分析可為耐鹽堿牧草品種的選育與生產提供一定的科學依據，尤其在紫花苜蓿耐鹽堿機制的研究上應用最為廣泛。An等[44]利用離子激流測序技術分別分析了在鹽堿溶液中生長0、1和7 d后的紫花苜蓿幼苗的整株轉錄組，發現在處理1和7 d后分別有2 286和 2 233個差異表達基因，有109和 96個轉錄因子發生了顯著地變化，同時通過測定生理指標發現活性氧清除系統、丙二醛和葉綠素含量等都發生了明顯的改變，此研究為探究紫花苜蓿適應鹽堿脅迫的生理與分子機制提供了新的思路。Gruber等[45]通過分析和比較兩種新型耐鹽性南美紫花苜蓿轉錄組數據，選擇出更為耐鹽的新品種；陳冉冉等[46]通過大豆堿脅迫轉錄組數據篩選到一個在堿脅迫下上調表達的假定蛋白基因GsARHP(alkali stress related hypothetical protein gene)，并證明了GsARHP基因的超量表達可以增強紫花苜蓿的耐堿能力；馬進等[47]利用轉錄組測序技術發現紫花苜蓿根系對鹽脅迫的響應是多基因參與、多個生物代謝過程反應協同調控的過程，基因表達量的變化可能是調控的主要方式；張婧蕾等[48]以南方型紫花苜蓿耐鹽突變體為材料，通過轉錄組數據分析同樣鑒定出了苜蓿中與鹽脅迫應答相關的差異表達基因。

除了紫花苜蓿，轉錄組學還應用于霸王(Zygophyllum xanthoxylum)、羊草 (Leymu schinensis)以及鷹嘴豆(Cicer arietinum)等其他草類植物對鹽堿脅迫響應的研究中。Ma 等[49]首次對 50 mmol·L-1NaCl脅迫處理下的多漿旱生植物霸王進行轉錄組測序，共得到106 423條Unigenes序列，通過數字基因表達譜分析表明在鹽和滲透脅迫下，霸王的根、葉中與離子轉運、光合作用途徑以及活性氧清除系統相關基因的表達豐度都有明顯的上調，并鑒定出了霸王響應鹽脅迫的關鍵基因，為干旱地區重要栽培牧草和作物品種抗逆性的遺傳改良提供了豐富的遺傳資源。Sun等[50]分別構建了在空白 對 照 以 及 100 mmol·L-1NaCl與 200 mmol·L-1NaHCO3處理下羊草的cDNA文庫，利用Roche-454對這兩個不同的cDNA文庫進行了大規模焦磷酸合成測序和分析，得到了同對照相比在鹽堿處理下的36 497個上調表達基因和18 218個下調表達基因，通過基因注釋和通道富集分析發現這些差異基因主要與羊草脅迫響應、信號轉導、能量生產和轉換以及無機離子轉運有關。Molina等[51]利用深度 SAGE 測定了在 25 mmol·L-1NaCl處理下鷹嘴豆的轉錄組，分析篩選得到了同活性氧清除系統以及Na+平衡相關的差異表達基因，為耐鹽品種的培育提供了一定的依據。

3.2.2 對極端溫度的適應機理

極端溫度脅迫包括低溫脅迫與高溫脅迫，是危害牧草的主要環境脅迫之一，嚴重損害了牧草的生長和生產潛能。目前轉錄組學在這方面的研究主要集中在牧草適應低溫脅迫及冷馴化上，在其適應高溫脅迫方面的研究較少。張美萍等[52]通過對l6個紫花苜蓿中逆境應答Ca2+-ATPase家族的轉錄組數據分析，發現多數紫花苜蓿Ca2+-ATPase家族基因受低溫和冷凍脅迫的誘導表達，為揭示苜蓿在低溫冷害應答中的功能提供了重要的參考。顏朗等[53]通過轉錄組數據分析揭示了皇竹草(Pennisetum sinese)的抗凍特性，對熱帶引種植物分子育種的開展提供了參考；付娟娟[54]采用RNA-seq高通量測序技術，探究了西藏野生垂穗披堿草(Elymus nutans)在低溫脅迫下的基因表達響應，揭示了其適應低溫的分子機制；Abeynayake等[55]在對適應不同氣候類型的兩種不同基因型多年生黑麥草(Lolium perenne)進行低溫馴化17 d后，分離出這兩種多年生黑麥草在不同時間點的總RNA，通過Illumina測序并分析，結果表明在低溫馴化中，這兩種不同基因型的多年生黑麥草響應低溫脅迫的晝夜節律網受到了干擾，揭示了多年生黑麥草在低溫馴化中的分子機制。曹路等[56]利用Illumina測序技術對多年連續模擬增溫處理的荒漠草原區短花針茅(Stipa breviflora)在果后營養期進行了轉錄組測序，分析得到了 131 779 個 hranscript和 54 075條 Unigenes，并將 1 791個 DEGs在 151個代謝通路中進行了注釋，此研究為保護野生飼草的種質資源提供了一定的試驗依據。

3.2.3 抗旱機制

干旱也是影響牧草生產力的主要環境因素之一，通過轉錄組測序探究牧草適應干旱脅迫機制的報道不是很多。冷暖等[57]采用高通量Illumina測序平臺對在對照和干旱處理下的草地早熟禾(Poa pratensis)進行轉錄組測序并分析，共檢測得到24 465個差異表達基因，其中有4 143個上調基因和4 415個下調基因，通過富集分析發現了與蛋白激酶、蛋白磷酸酶、碳代謝以及ABA等草地早熟禾干旱響應機制相關的基因，此研究為揭示草地早熟禾應答干旱脅迫的分子機制奠定了基礎。Ma等[49]通過對-0.5 MPa滲透脅迫處理下的霸王進行了轉錄組測序，鑒定出了霸王響應干旱脅迫的關鍵基因，為干旱地區重要牧草和作物品種抗逆性的遺傳改良提供了豐富的遺傳資源。

3.2.4 對礦質營養虧缺和重金屬脅迫的適應機制

Byrne等[58]利用微陣列(microarray)測序技術研究了在缺磷(P)條件下生長的多年生黑麥草中基因的表達情況，并進行了氣相色譜-質譜代謝圖譜分析，結果發現在磷缺乏24 h后，多年生黑麥草的代謝產物和轉錄本都發生了明顯的變化，表明了多年生黑麥草主要是通過磷脂的替代和糖酵解旁路來響應缺磷脅迫的。丁氏清茶[59]測定分析了在鎘(Cd)處理下的甜高粱(Sorghum bicolor)轉錄組，分別在甜高粱莖和葉中得到了668和286個差異表達基因，并且通過檢測得到了35個與重金屬轉運蛋白及解毒相關的顯著表達基因，此研究為進一步研究植物在鎘污染土壤中自身修復的基因網提供了參考。Montero-Palmero 等[60]將在3 μmol·L-1汞(Hg)處理3、6和24 h后紫花苜蓿根全基因組轉錄譜同蒺藜苜蓿(M. tructunla)微陣列進行比較分析，發現在紫花苜蓿根中有559個差異表達基因且有91%的基因表達上調，而且大部分基因在汞處理3和6 h后都有所表達，它們主要同植物脅迫響應、次級代謝和激素代謝有關。同時還發現乙烯參與了苜蓿對汞脅迫的早期響應，調節了根系生長抑制、NADPH-氧化酶活性和汞誘導的H2O2積累。Liu等[61]利用Illumina測序分析了在鋁(Al)脅迫4、8和24 h后紫花苜蓿根中轉錄組的變化情況，共得到2 464個差異表達基因，而且大多數都是在脅迫早期(4 h)和晚期(24 h)時表達上調，通過代謝通路富集分析發現這些差異基因參與了核糖體和蛋白質的生物合成與加工、檸檬酸循環、膜轉運以及激素調節，說明紫花苜蓿體內解毒機制在鋁脅迫中發揮了重要的作用，此結果有助于了解苜蓿響應鋁脅迫的分子機制。

這些研究有助于對牧草響應礦質元素缺乏和金屬離子脅迫的分子機制的了解，并為在重金屬污染地區植物適應性改良提供新的思路。

4 分子標記開發

4.1 SSR分子標記

隨著分子技術的快速發展，DNA分子標記作為一種全新的鑒定方法，由于其簡單高效、成本低且重復性好等優點，已被普遍應用于物種和品種的鑒定，其中簡單重復序列(simple sequence repeats, SSRs)分子標記應用最為廣泛。SSR標記，又稱為微衛星 DNA (microsatellite DNA)標記，是一種新興的分子標記技術。SSR大量存在于真核基因組中，其多態性高、技術重復性好、易于操作。隨著生物學技術的不斷發展，植物表達序列標簽(expressed sequence tags, ESTs)已 經 成 為 了 開 發SSR分子標記的重要資源，EST-SSR標記廣泛應用于植物遺傳育種、品種鑒定、種質資源保護和DNA 指紋圖譜建立等方面[62-63]。牧草中的EST-SSR標記開發已得到了越來越多的研究者的關注，截至目前已有多種物種通過轉錄組測序開發了ESTSSR分子標記，如紫花苜蓿、老芒麥(Elymus sibiricus)、狗尾草、羊草、箭筈豌豆(Vicia sativa)以及無芒隱子草(Cleistogenes songorica)。

陳天龍[64]利用紫花苜蓿轉錄組測序結果開發了107對EST-SSR引物，為苜蓿育種研究的開展奠定了基礎。Liu等[65]通過轉錄組測序在紫花苜蓿中也開發出了EST-SSR標記，促進了與苜蓿有關的遺傳和分子育種研究的發展。Zhou等[66]利用IlluminaHisSeq 2 000測序平臺對老芒麥愈傷組織、幼根和幼苗等11個不同組織進行了轉錄組測序，根據測序結果開發了112個具有多態性的ESTSSR分子標記，并揭示了這112對引物在E. abolinii和E. antiquus等13個披堿草屬物種中的通用性，推動了老芒麥以及披堿草屬植物的遺傳多樣性和分子標記輔助育種。Xu等[67]利用第二代測序技術測定分析了狗尾草不同發育時期不同組織和器官的轉錄組，以狗尾草基因組42 754個轉錄本為參考，組裝后共得到60 751個轉錄本，分別在參考組和轉錄組中鑒定出了9 576和 7 056個SSR標記，這些SSRs標記的發現為狗尾草的遺傳學研究提供了一定的幫助。Chen等[68]從羊草轉錄組87 214 個 Unigenes中鑒定出了 3 818 個 EST-SSR 標記，并分析了這些SSRs的核苷酸重復序列和主要顯性序列，發現三核苷酸序列在羊草SSRs中比例最高(74.12%)，且CCG序列在三核苷酸序列中占主導地位，其次是AGG和AGC，二核苷酸序列主要為AG和AC，這與在小麥和大麥(Hordeum vulgare)中的結果類似。他們還發現了109個包含ESTSSR且與冷響應相關的Unigenes，它們主要編碼轉錄因子和蛋白激酶等調節蛋白。此研究結果豐富了羊草的轉錄組，為其分子育種提供了寶貴的資源。Liu等[69]從箭筈豌豆轉錄組中超過1 000 bp長度的1 025個 Unigenes中鑒定得到了1 071個潛在的EST-SSR標記，并設計合成了450對引物，最終對10個箭筈豌豆種質開發了95對多態性引物，其中包括50個獨立引物。這95個EST-SSR標記的開發促進了箭筈豌豆遺傳和分子育種的研究。Zhang等[70]構建了在干旱脅迫下無芒隱子草葉和根的cDNA文庫，對5 664個隨機cDNA克隆進行表達序列標簽(EST)測序后共得到3 579個高質量的修剪序列，修剪后的ESTs平均長度為613 bp，并且在這些ESTs中發現了161個SSR。該研究中構建的cDNA文庫和得到的ESTs有助于了解無芒隱子草抗旱性的潛在分子機制(表2)。

表2 應用轉錄組測序開發了分子標記的牧草種類Table 2 Species of forage that have developed the molecular marker by transcriptome sequencing

4.2 SNP分子標記

SNP (single nucleotide polymorphism)標 記 ， 即單核苷酸多態性標記，指在基因組上由單個核苷酸的變異形成的遺傳標記，其數量很多，多態性豐富，是目前遺傳標記中研究最多和最有前景的分子標記。Lander[75-76]在1996年正式指出SNP開啟了分子標記新時代，該分子標記是在以SSR和ISSR為代表的第二代分子標記基礎上發展起來的第三代分子標記技術。SNP標記作為目前最具發展潛力的分子標記，適合于數量龐大的檢測分析，已被廣泛應用于生物、農學、醫學、生物進化等眾多領域[77]。同EST-SSR相比，SNP標記在牧草中的研究不是很多。Li等[71]通過轉錄組測序，研究了27種不同基因型苜蓿中的SNPs，發現在優良紫花苜蓿繁殖種群中存在大量的單個SNPs標記，而在未改良的紫花苜蓿種質中SNP的多樣性明顯較低。Yang等[72]通過轉錄組數據分析，發現SNP和候補基因的鑒定有利于紫花苜蓿在飼料與纖維素方面的改良。Studer等[73]利用二代測序技術鑒定了多年生黑麥草中的SNPs，該研究是多年生黑麥草SNP標記基因的發現和相應的轉錄序列遺傳確立的重要里程碑，并為其遺傳育種提供了一種新的策略。Huang 等[74]通過 IlluminaHiSeq 2 000 測序平臺測定了兩種不同基因型的鴨茅(耐熱型和熱感型)轉錄組，并從中鑒定得到了基因相關分子標記包括SSRs和SNPs以及熱應激差異表達基因，此研究說明轉錄組測序為SNPs和SSRs開發和利用提供了有用的分子信息。

5 展望

轉錄組測序是分析基因表達差異、基因結構變異、篩選分子標記、完善和優化基因結構、鑒定可變剪接體以及RNA編輯的重要手段。相較于傳統芯片，轉錄組測序不需要預先設計探針便可對任意物種的任意組織和細胞進行測序，可以提供更準確的數字化信息、更高的檢測通量和更廣泛的檢測范圍，已廣泛應用于代謝工程、醫藥和植物細胞特性改造等諸多領域。

目前，第二代測序在牧草生長發育、抗生物脅迫和非生物脅迫機制研究、優異基因資源的挖掘以及分子標記方面已得到了較為廣泛的應用，為優良牧草新品種的培育提供了理論指導。但當前已完成轉錄組測序的牧草種類仍然較少，而且在牧草品質性狀、基因優化及利用轉錄組數據進行ILP分子標記以及LTR分子標記的開發等方面的研究甚少。為了達到更高的測序精確度、更大的測序通量、更短的測序時間以及更低的測序成本，出現了第三代測序技術即單分子測序，其不需要進行PCR擴增即可在單分子水平上進行檢測。雖然目前單分子測序技術在牧草研究上還不夠成熟，但隨著生物技術的不斷發展，第三代測序技術勢必會在牧草研究上得到廣泛的應用，為牧草種質資源的開發與利用、牧草分子育種以及牧草優異抗逆基因的挖掘提供更加準確的參考，必將為推動畜牧業的健康和可持續發展做出更大的貢獻。