能源植物柳枝稷基因工程研究進展

曹慧穎，張立軍，阮燕曄，張 敖，董小妹，張馨悅

（沈陽農業大學生物科學技術學院 / 遼寧省植物基因工程技術研究中心, 遼寧 沈陽110866）

改革開放以來，中國經濟持續高速發展，目前已經成為僅次于美國的第二大經濟體[1]。經濟的發展伴隨著能源的巨大消耗，但我國的能源分布情況是富煤、貧油、少氣。從1997年開始，中國成為能源的純進口國，1998年石油進口量為0.55億t，而 2015年石油進口量升至3.36億t[2]，石油進口量正以驚人的速度攀升。能源不足，是困擾中國經濟發展的重要問題。除了進口，科學家們正在努力從多個角度開發新能源，比如風能、太陽能、核能、水能、地熱能。在生物領域，植物通過光合作用將大量能量儲存在其生物質中，因此研究利用植物生物質能源是一個重要課題。柳枝稷(Panicum virgatum)也因此受到更多研究者的關注。

柳枝稷屬于禾本科黍屬，起源于北美。其根系發達，生產力高，水利用率高，同時環境適應性好，在干旱、貧瘠甚至是鹽堿地都能生長[3-4]。研究發現，將柳枝稷的生物質與煤炭混燃發電，是生物質利用成本最為低廉的方式。將10%柳枝稷和90%煤炭混合具有較好的燃燒性能，SOx和NOx的排放量也相應降低[5]。儲存在柳枝稷纖維素生物質中的多糖可以通過微生物發酵、高溫分解或者氣化轉化為生物燃料，美國能源部已經把柳枝稷作為專用的能源作物[6-8]，我國已經引種并且正在推廣[9-10]。

由于柳枝稷木質素含量高，同時進一步提高抗逆性有利于其更好地服務于能源生產，因此有必要對柳枝稷進行適當的遺傳育種改良[11]。但是柳枝稷具有自交不親和及異源多倍體等遺傳特性，應用傳統育種方法難以改良[12]?；蚬こ碳夹g是一種快速、有效的育種手段，可以克服傳統育種方法的不足。本文從基因型、遺傳轉化方法及功能基因改良等方面綜述能源作物柳枝稷的基因工程研究進展，以期為培育更加優良的柳枝稷品種、提供新能源材料奠定基礎。

1 柳枝稷遺傳轉化影響因素

1.1 轉化技術的影響

植物基因工程育種是一種快速、便捷的育種技術，可以克服傳統育種周期長、不能實現超遠緣雜交等缺點。但是要應用該技術，首先要建立高效的柳枝稷遺傳轉化體系。目前柳枝稷的轉化主要采用農桿菌介導法。農桿菌能將自身染色體外Tumor-inducing (Ti)質粒的一段 DNA (T-DNA)轉移到宿主植物細胞中，如果有外源基因插入到T-DNA中，也可以隨著T-DNA的轉移一起整合進入植物基因組[13]。農桿菌介導的遺傳轉化系統最早被應用在雙子葉植物中，由于單子葉植物尤其是禾本科植物不是農桿菌的天然宿主，所以該系統在單子葉植物中的應用進展緩慢。之后隨著人們對農桿菌侵染機制了解的深入，轉化技術也有所改進完善，農桿菌介導的遺傳轉化首先在水稻(Oryza sativa)[14]和玉米(Zea mays)[15]中取得了突破性進展。與其他轉基因技術相比， 農桿菌介導的遺傳轉化系統具有遺傳穩定、拷貝數低、成本低和基因沉默現象少等優點[16-17]。

為了提高農桿菌介導的植物遺傳轉化效率，在實際工作中，研究人員開發出一些輔助措施，以增加外源DNA進入宿主細胞的幾率。如使用超聲波[18-19]、真空滲透[19]、熱激、離心[20]、表面活性劑[21]、碳化硅纖維[22]處理外植體，以及共培養時使用半胱氨酸等巰基化合物[23-24]等。這些輔助技術也被應用在柳枝稷轉化中。

Li等[25]在柳枝稷的轉化中，首先由種子誘導愈傷組織，農桿菌侵染愈傷組織的過程中，進行真空減壓。隨后的共培養階段，并不使用培養基，而是直接將愈傷組織放在一張濾紙上進行干燥處理。共培養之后，沒有直接進入選擇培養階段，而是將愈傷培養在不含篩選抗生素的培養基上稍作休息，讓外源基因復蘇，再進行篩選。同時在愈傷誘導和選擇階段添加脯氨酸。通過這樣的轉化流程，48.5%的Alamo愈傷組織和90.3%的Performer愈傷組織可以檢測出潮霉素抗性。筆者也通過真空滲透加干燥的處理方法，得到了40%以上的Alamo愈傷組織出苗率(數據未發表)。

有報道[26]稱，農桿菌侵染前將愈傷組織置于3% 麥芽糖、300 μmol·L-1谷氨酰胺 (Gln)溶液中冰浴20 min，隨后的轉化中，也采取真空、干燥處理，結果表明，AlamoⅡ型愈傷組織轉化效率可達72%，Performer轉化率高達96%；即使是高地型品種Blackwell也獲得成功轉化，轉化效率為5.6%。一些柳枝稷轉化試驗的結果如表1所列，可以看出，即使是同一個品種、不同實驗室、不同轉化方法獲得的轉化率也不盡相同。但值得注意的是，不同文獻采用的轉化率計算方法也不完全一致。

1.2 基因型對遺傳轉化的影響

柳枝稷因其原產地緯度不同，可以分為低地和高地生態型[33-34]。低地生態型起源于低緯度地區，喜好溫暖濕潤的氣候環境，其株型高大，生物量高，但耐寒性差，主要品種有Alamo、Performer、Bomaster、Kanlow和Colony等。髙地生態型起源于較高緯度地區，其莖稈略微細矮，生長較慢，生物量較低，但抗旱、耐寒能力強，其品種有Blackwell、Cave-in-Rock、Trailblazer、Carthage和Shawnee等[35]。

柳枝稷染色體基數 x = 9，它的倍性從 2 n =18 到 2 n = 108 都有分布，最常見的倍性是 2 n = 4 x =36 和 2 n = 8 x = 72 兩種[36-38]。由于基因型不同，不同柳枝稷品種的組培再生能力及遺傳轉化效率明顯不同[39]。劉燕蓉和張萬軍[40]對11個不同生態型柳枝稷品種進行組織培養，并統計分析其愈傷組織形態及比例，結果表明，低地型品種Alamo和Performer的種子發芽率和愈傷誘導率均較低，但容易分化、色澤鮮亮、結構松脆的Ⅱ型愈傷組織比例高；雖然高地型品種Dacotach、Blackwell和Nebraska 28的愈傷誘導率和種子發芽率較高，但Ⅱ型愈傷組織較少，不易獲得組培再生苗。

表1 柳枝稷遺傳轉化方法Table 1 The method of genetic transformation of switchgrass

Ogawa等[27]誘導柳枝稷種子形成結構致密、生長較慢的Ⅰ型愈傷組織，并利用農桿菌介導轉化低地品種Alamo、Kanlow以及高地品種Trailblazer，但在該試驗所采用條件下，高地品種Blackwell、Cave-in-Rock不能產生Ⅰ型愈傷組織。目前柳枝稷轉基因研究常選用低地型品種，如Alamo。高地型品種由于基因型復雜等原因，愈傷組織再生及遺傳轉化均較低地型困難。

2 柳枝稷功能基因改良

2.1 降低木質素含量

植物生物質的主要成分為木質纖維素，包括半纖維素、纖維素和木質素等。木質素不但難以轉化利用，而且還影響纖維素的生物降解。有研究指出，木質素含量為22%的原料可產生的糖只有木質素含量為17%的原料的一半，木質素含量為26%的原料幾乎不產糖[41]。因此植物生物質必須經過預處理破壞木質素對纖維素的包裹[42]，纖維素和半纖維素才可通過水解和發酵來生產乙醇。柳枝稷的木質素含量為17.56%，與常見的農業副產物玉米秸(18.59%)、麥稈(16.85%)木質素含量持平(表2)。如果采用生物技術適當降低木質素含量，就可以更好地利用柳枝稷的生物質[43]。

表2 一些常見能源植物的物質組成Table 2 Composition of some prospective energy crops

肉桂醇脫氫酶(CAD)是木質素合成途徑的一個關鍵調控酶，它可以將木質素前體轉化成木質素單體。已有報道通過下調柳枝稷CAD基因的表達，降低柳枝稷體內木質素的含量，從而使柳枝稷中糖化效率達到23%，并且不需要酸預處理[29, 44]。類似的可以降低木質素含量的酶還有咖啡酸-O-甲基轉移酶(COMT)。木質素是由多種芳香醇單體形成的一種復雜酚類聚合物，COMT是參與苯丙酸途徑中的一個甲基化酶。Fu等[45]下調了COMT基因的表達，在沒有酸預處理的情況下，糖化效率增加了 29.2%～38.3%。然而有研究指出, 下調COMT的柳枝稷中低分子量酚類化合物會抑制糖化作用以及釀酒酵母的發酵[46]。另有研究表明，MYB家族轉錄因子調控植物木質素生物合成過程，對植物木質素含量及結構都起到了重要作用。Shen等[47-48]在柳枝稷中過表達了R2-R3-MYB轉錄因子家族的PvMYB4，在未經酸預處理的條件下就可以使糖化效率增加300%，最終使纖維素乙醇產量比普通植株提高了2.6倍。

2.2 提高生物量

MicroRNA(miRNA)是真核生物及病毒中存在的由19～24 nt組成的一類內源性非編碼的單鏈小RNA，能夠識別并指導靶基因的降解或者抑制靶基因的翻譯。已有研究表明，miRNA廣泛參與調控植物的生長發育、細胞分化、形態建成及激素代謝等各種過程[49]。miR156是植物中鑒定的第1個miRNA，在柳枝稷中miR156通過調控植物特有的一類多功能的轉錄因子家族SPL (SQUAMOSA promoter binding like)控制植物發育階段。Fu 等[50]利用基因工程的方法過表達了miR156b前體基因，在較低的miR156表達水平下，柳枝稷可以正常開花，并且生物量增加了58%～101%。

蔗糖合成酶(SUS)催化蔗糖和UDP轉變為UDP-葡萄糖和果糖，UDP-葡萄糖又可在纖維素合成蔗糖合成酶(SUS)催化蔗糖和UDP轉變為UDP-葡萄糖和果糖，UDP-葡萄糖又可在纖維素合成酶作用下轉變成組建細胞壁的纖維素。Poovaiah等[31]鑒定了4個柳枝稷SUS，過表達pvSUS1的轉基因柳枝稷，植株高度增加37%，生物量增加13.6%。

2.3 抵抗逆境脅迫

自然環境中的植物，經常受到生物脅迫，比如病原菌的侵染。同時因其不可移動性，還要忍受干旱、洪澇、低溫以及鹽堿等非生物脅迫。研究發現，一些miRNA在抵抗逆境脅迫中發揮了重要的作用[51]。Matts等[52]利用生物信息學結合實驗生物學的方法，鑒定了20個柳枝稷保守miRNA家族，預測了37個miRNA的靶基因。通過對miR395和miR399表達模式的分析，并且比較了它們在擬南芥(Arabidopsis thaliana)和蒺藜苜蓿(Medicago truncatula)中的表達，發現這兩個miRNA與柳枝稷在貧瘠土壤中的生長適應性有關。

Xie等[53]對柳枝稷進行了干旱和鹽處理，隨后用測序的方法在該材料中鑒定出17個與干旱有關的 miRNAs，其中 4個是保守的 miRNAs，另外13個是柳枝稷特有的miRNAs。另有研究從柳枝稷中克隆了Pvi-MIR319a，并且用反向遺傳學的方法研究了它的功能[54]。過表達Pvi-MIR319a的水稻表現出葉片寬大、植株矮小、開花延遲等表型，說明該基因對植株發育具有重要的調控作用，因此Pvi-MIR319a也被認為是柳枝稷遺傳改良的良好候選基因。

多年生柳枝稷因其具有較高木質纖維素含量而成為生物能源生產的重要原料。如果通過代謝工程和基因工程進一步降低木質素含量，增加產量，提高抗脅迫能力，將使柳枝稷成為更為理想的能源作物。目前柳枝稷基因工程概況如表3所列。

表3 柳枝稷基因工程概況Table 3 Summary of genetic modifications of switchgrass

3 研究展望

植物基因工程是把特定基因引入到宿主細胞，并整合到宿主基因組，從而改變宿主的遺傳組成，產生具有特定性狀的轉基因植物。該技術是對傳統育種方法的有益補充，也是改善作物品質、提高作物產量的重要手段。目前，轉基因技術已經在大豆(Glycine max)、玉米、棉花(Gossypium hirsutum)、油菜(Brassica campestris)等植物中廣泛應用，生產出了抗蟲、抗病、抗除草劑等多個品種，產生了巨大的經濟效益和社會效益。將基因工程技術應用到柳枝稷中，從而增加燃料乙醇的生產率，也必將成為柳枝稷育種的重要方面[55-56]。

柳枝稷的重要應用價值是生產纖維素乙醇，但實際生產中遇到了二代乙醇生產成本過高的問題。成本消耗在預處理、糖化、發酵等各個步驟。通過基因工程，改變柳枝稷結構組成，簡化生產步驟，降低成本，可為開發經濟可行的生產工藝奠定基礎?？尚械牧︷⑦z傳工程改造包括降低木質素含量，改變細胞壁中糖的組成，從而使糖可以最大限度轉化成為生物燃料。也有學者提出可以降低細胞壁交聯來增加有效生物質[43]。所有這些工作都需要對柳枝稷進行系統的功能基因組學研究，詳細了解各基因功能及其代謝調控，才能篩選出目的基因。Okada等[57]以柳枝稷Kanlow為母本、Alamo為父本進行雜交，雜交后代利用SSR標記繪制了遺傳圖譜。USDOE-JGI基于Roche 454和Illumina平臺對柳枝稷開展了全基因組測序分析，致力于提供重要功能區域準確、全面的參考基因組信息，目前已經獲得的序列信息公布于網站http://switchgrassgenomics.org/[58]。柳枝稷基因組研究的開展，有助于發現與細胞壁組成、作物產量和其他抗逆性相關的基因。科學家通過比較柳枝稷和水稻、高粱及其他植物的基因組數據，可以更好地理解柳枝稷基因組，為柳枝稷提供更多的生物燃料奠定堅實的研究基礎。