氣虛血瘀型肺間質纖維化大鼠模型建立及HGF和CTGF的動態表達

王海霞，沈明霞，謝海彬，趙鯤鵬，李雪燕，張旭輝，張帆，馬玉坤，李紅，*

(1.甘肅中醫藥大學，甘肅 蘭州 730000；2.甘肅中醫藥大學附屬醫院，甘肅 蘭州 730000)

肺間質纖維化(Pulmonary fibrosis，PIF)是一種慢性、進行性、不可逆性肺部疾病[1]，發病率[2]及死亡率[3]逐年增高，且發病機制不明，西醫缺乏有效治療手段[4-5]，目前中醫藥治療成為研究熱點，但是單純的證候動物模型或疾病動物模型已不能滿足現代醫學探索證候診斷標準和演變規律的需要，多因素復合模型憑借其分別或同時采用中醫學病因復制證候模型和現代醫學病因復制疾病動物模型，能同時表現出疾病和證候特征的優勢而逐漸被應用，因此，證候動物模型制作的合理性決定了證候實驗研究的成敗。本實驗以PIF的主要證候氣虛血瘀證為切入點，采用力竭游泳+高脂飲食+氣管內推注博來霉素法建立氣虛血瘀型PIF大鼠模型，完善該模型的評價體系，以便遣方用藥，提高臨床療效。

肝細胞生長因子(Hepatocyte growth factor，HGF)能夠促進受損組織重建，抑制纖維化發生，結締組織生長因子(Connective tissue growth factor，CTGF)作為肺纖維化的標志，可介導成纖維細胞增殖，促進PIF的進展。通過觀察HGF及CTGF在氣虛血瘀型PIF大鼠病程中動態表達及兩者之間的變化趨勢，了解促纖維化與抗纖之間的關系，為后期防治纖維化及延緩疾病進程提供治療方向。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SPF級Wistar大鼠80只，雌雄各半，體質量(200±10)g，許可證號：SCXK(甘)2015-0002。實驗前動物適應性喂養1周。

1.2 試劑及實驗器材

注射用鹽酸博來霉素(海正輝瑞制藥有限公司，批號：17121941)；中/長鏈脂肪乳注射液(C8-24Ve)(西安立邦制藥有限公司，批號：H20055883)；4%多聚甲醛(北京索萊寶科技有限公司，批號：P1110)；熒光定量試劑盒Go Taq?qPCR Master Mix(Promega，批號：A6001)、反轉錄試劑盒RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit(Thermo，批號：K1622)，引物由寶生物工程(大連)有限公司設計；HGF ELISA試劑盒(Jiangsu Fiya Biological Technology Co,Ltd，批號：MM-0152R1)；CTGF ELISA試劑盒(Jiangsu Fiya Biological Technology Co,Ltd，批號：MM-0084R1)；石蠟切片機(德國，RM2135)；石蠟包埋機(日本，TEC-VEM-J2)；石蠟脫水機(日本，VIP-5JR-J2)；倒置相差顯微鏡(日本OLYMPUS公司，IX81)；B2級生物安全柜(HF safe-1200 B2，上海)；紫外可見分光光度計(Thermo BioMate 3S，美國)；PCR擴增儀(Bio-Rad icycle IQ，美國)；熒光定量PCR儀(FTC-3000P，加拿大)。

1.3 方法

1.3.1 分組與造模

大鼠適應性飼養1周后，開始力竭游泳+高脂飲食法證候造模。

力竭游泳法[6-7]：先進行1周的適應性游泳訓練，隔日1次，每次2 min，之后進行力竭游泳，水溫37℃，水深35 cm，鼠尾根部按體重的5%負重。力竭標準：連續沉入水中3次且每次>5 s，游泳隔日1次。

高脂飲食[8-9]：脂肪乳按10 mL/(kg·d)灌胃1次。于造模第10天、20天、30天分別進行氣虛血瘀證候評分[10]。評分達到成功標準者，為證候造模成功大鼠。

選取證候造模成功大鼠，采用氣管內推注博來霉素法建立氣虛血瘀型PIF大鼠模型。大鼠用10%的水合氯醛(1 mL/100g)腹腔麻醉后，仰臥位固定于操作臺，備皮、消毒、暴露氣管，用1 mL注射器抽取博來霉素溶液(用0.9% Nacl溶液將博來霉素配制成5 mg/mL)，以氣管軟骨環間隙為定位朝向心端刺入氣管，有落空感后注射器微微上翹使針頭平行進入，迅速將藥液注入氣管，給藥量為5.0 mg/kg[11-12]，然后拔出針管將大鼠頭高腳低位均速并連續旋轉1 min，使藥液均勻分布于兩側肺中，完成后縫合切口，常規消毒，給予紅霉素軟膏涂抹傷口以預防感染。空白組大鼠按同樣方法氣管內推注等體積生理鹽水。待動物自然清醒后常規飼養。

1.3.2 氣虛血瘀證癥狀量化評分表

結合2002年出版《中藥新藥臨床研究指導原則(試行)》中的血瘀證部分和氣虛證部分的癥狀分級量化評分表及實驗中觀察所得設計出“大鼠氣虛血瘀證癥狀量化評分表”[13]。具體見表1。

表1 氣虛血瘀型大鼠癥狀量化評分表

注：總分共計15分，其中氣虛血瘀證Ⅰ度：2～5分；氣虛血瘀證Ⅱ度：5～9分；氣虛血瘀證Ⅲ度：9～13分，氣虛血瘀證Ⅳ度：13～15分。

1.3.3 大鼠游泳時間測定

每天灌胃1 h后，除空白組外，測定其余大鼠強迫游泳至疲勞狀態的時間(即大鼠從入水到力竭為止)。

1.3.4 一般情況觀察及指標檢測

參照表1進行觀察，并記錄體質量、進食量。將造模后第7天、14天、28天大鼠分批處死。麻醉后心臟采血5 mL，頸椎脫臼法處死，沿胸腔兩側剪斷肋骨，暴露心肺，完整分離出氣管和雙肺并去除周圍結締組織，預冷生理鹽水沖洗干凈，濾紙吸干，取右下肺固定于4%多聚甲醛中，進行HE、Masson染色。

1.3.5 肺組織病理損傷、纖維化判斷

染色后，在顯微鏡下觀察肺組織HE、Masson情況并根據Szapiel[14]標準進行評分，具體見表2和表3。

1.3.6 ELISA法檢測血清中HGF及CTGF的表達

心臟取血并以4℃，3 500 r/min離心10 min，收集血清,-80℃存儲,用于血清HGF、CTGF測定，檢測方法嚴格按照說明書進行。

表3 Masson染色后肺組織纖維化評分

1.3.7 熒光定量PCR檢測肺組織HGF、CTGF mRNA表達

取肺組織100 mg，按Trizol法提取總RNA；用紫外

可見分光光度計測定總RNA濃度及純度后，cDNA合成利用RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit，操作方法步驟參照說明書進行。按照熒光定量試劑盒Go Taq?qPCR Master Mix配制反應體系后進行熒光定量PCR反應。

反應體系：Nuclease-Free Water(7.2 μL)；上下游引物10 μM(0.4 μL)；Go Taq?qPCR Master Mix2×(10 μL)；cDNA(2 μL)。

反應體系：95℃預變性2 min；95℃ 15 s，60℃ 30 s，72℃ 30 s，40個循環最后采用2-ΔΔCT法計算mRNA的相對表達量。上下游引物序列，見表4。

1.4 統計學處理

采用SPSS21.0統計軟件進行統計分析，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，不同時間點重復測量采用重復測量計量資料方差分析，以P≤0.05表示差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 氣虛血瘀模型評價要素

2.1.1 氣虛血瘀模型大鼠表征

采用力竭游泳+高脂飲食法造模后，大鼠活動量減少，反應遲鈍，出現各種程度的精神萎靡、喜扎堆蜷臥，被毛枯槁、脫落，大便量明顯增多，糞質稀軟，不同部位(如口唇、齒齦、爪甲、耳緣)可出現不同程度的脈絡瘀阻。而空白組大鼠體質量逐漸增加，反應靈敏，被毛始終潤滑有光澤，大便正常，各部位極少出現血瘀等情況。見圖1。

注：A：未力竭狀態；B：力竭狀態；C：空白組-舌體；D：模型組-舌體；E：空白組-舌底；F：模型組-舌底；G：空白組-唇周；H：模型組-唇周；I：空白組-耳緣；J：模型組-耳緣；K：空白組-大便；L：模型組-大便。圖1 氣虛血瘀模型大鼠表征圖片

2.1.2 力竭游泳時間

大鼠力竭游泳時間先上升到達一定程度后又逐漸下降，總體呈逐漸下降趨勢，末次游泳時間低于初次游泳時間，說明負重游泳后逐漸出現疲乏無力，最終呈現氣虛狀態。見表5、圖2。

表5 大鼠游泳時間

注：時間因素主效應，F=7.961，P<0.01；與第1天比較,aP<0.01，bP<0.05；與第3天比較,cP<0.01，dP<0.05；與第5天比較,eP<0.01，fP<0.05；與第7天比較,gP<0.01，hP<0.05；與第9天比較,iP<0.01，mP<0.05；與第11天比較,nP<0.01；與第13天比較,lP<0.01。

2.1.3 體質量比較

動態觀察大鼠的生長狀況，結果空白組與氣虛血瘀模型組大鼠體質量均較前一個時間點增加，差異有統計學意義(P<0.01)；氣虛血瘀模型組大鼠體質量較空白組增長較慢，但差異無統計學意義(P>0.05)；時間和分組對體質量的變化有交互作用(P<0.05)。見表6、圖3。

2.2 氣虛血瘀模型大鼠癥狀量化評分

氣虛血瘀模型大鼠造模各時間段均出現不同程度的氣虛血瘀癥狀，且程度隨造模時間延長而逐漸加重，較空白組差異顯著(P<0.01)，其中第10天氣虛血瘀評分為Ⅰ度；第20天評分為Ⅱ度；第30天評分為Ⅲ度。見表7。

表6 兩組大鼠體質量比較

注：處理因素主效應，F=1.242，P>0.05；時間因素主效應F=116.234，P<0.01；兩者有交互作用，F=9.534，P<0.05；與造模前比較,aP<0.01；與造模1周比較,bP<0.01；與造模2周比較,cP<0.01；與造模3周比較,dP<0.01。

圖3 大鼠體質重方差輪廓圖

組別n第10天第20天第30天空白組150.60±0.520.50±0.530.70±0.48氣虛血瘀模型組614.90±0.61a7.65±0.71a9.65±0.53at-16.939-25.592-39.481P<0.01<0.01<0.01

注:與空白組比較,aP<0.01。

2.3 氣虛血瘀PIF模型大鼠肺系數

與對照組比較，同期氣虛血瘀PIF模型組肺系數明顯增高，差異有統計學意義(P<0.01，P<0.05)。結果見表8。

肺系數(%)=肺重(mg)/體重(g)×100%

表8 不同組別不同時間點氣虛血瘀型PIF大鼠肺系數比較

2.4 HE、Masson染色及評分

觀察肺組織HE染色發現，對照組各時間點大鼠肺組織結構完整，支氣管黏膜上皮及肺泡無變形，無細胞脫落，無炎性細胞滲出、聚集；氣虛血瘀PIF模型組7天：肺泡結構紊亂，肺泡腔塌陷，大量炎癥細胞浸潤，肺泡間隔增寬；14天：肺泡炎性細胞較前減少，肺泡壁明顯增厚，間隔增寬，成纖維細胞增生，逐漸出現纖維組織；28天：炎性細胞浸潤逐漸消失，肺泡結構破壞，間隔斷裂，伴隨大量成纖維細胞及膠原沉積。見圖4。

觀察肺組織Masson染色發現，對照組各時間點大鼠肺組織支氣管壁膠原層較薄，肺泡區有較少呈淺藍色的膠原纖維；氣虛血瘀PIF模型組7天：肺泡間隔增寬并出現藍色的膠原纖維，而在支氣管壁以及血管壁上亦可見到藍色的膠原纖維；14天：大量纖維增生，藍色膠原纖維出現于支氣管、血管外壁及增厚的肺泡隔內；28天：彌漫性肺纖維化形成，各區域均可見大量藍色膠原纖維增生出現。見圖5。

注：A：對照組7天；B：對照組14天；C：對照組28天；D：氣虛血瘀PIF模型組7天；E：氣虛血瘀PIF模型組14天；F：氣虛血瘀PIF模型組28天。圖4 大鼠肺組織HE染色(200×)

注：A：對照組7天；B：對照組14天；C：對照組28天；D：氣虛血瘀PIF模型組7天；E：氣虛血瘀PIF模型組14天；F：氣虛血瘀PIF模型組28天。圖5 大鼠肺組織Masson染色(200×)

肺組織病理損傷及肺纖維化評分較同期對照組均明顯增高，差異具有統計學意義(P<0.01)。見表9。

2.5 ELISA法檢測血清中HGF及CTGF的表達

與對照組比較，同期氣虛血瘀PIF模型組大鼠血清HGF表達明顯降低，差異有統計學意義(P<0.01)，且與纖維化程度成正比，其中氣虛血瘀PIF模型28天與模型7天比較，差異有統計學意義(P<0.05)。與對照組比較，同期氣虛血瘀PIF模型組大鼠血清CTGF表達明顯增高，差異有統計學意義(P<0.01，P<0.05)，且與肺纖維化程度成正比。見表10、圖6～7。

表9 各組大鼠不同時間點肺組織病理學評分比較

表10 各組大鼠血清中HGF、CTGF的含量比較

圖6 血清中HGF的含量

圖7 血清中CTGF的含量

2.6 肺組織中HGF及CTGF的表達

qRT-PCR結果顯示：與對照組比較，同期氣虛血瘀PIF模型組大鼠肺組織HGF相對表達量明顯降低，差異有統計學意義(P<0.01)，其中氣虛血瘀PIF模型28天與模型7天比較，差異有統計學意義(P<0.05)；與對照組比較，同期氣虛血瘀PIF模型組大鼠肺組織CTGF相對表達量明顯增高，差異有統計學意義(P<0.01，P<0.05)，且與肺纖維化程度成正比。見表11,圖8～9。

表11 各組大鼠肺組織中HGF、CTGF的相對表達量

圖8 肺組織HGF的相對表達量

圖9 肺組織CTGF的相對表達量

3 討論

本實驗以氣血理論為基礎，采用力竭游泳+脂肪乳灌胃的方法建立氣虛血瘀型大鼠模型，在此基礎上采用單劑量氣管內推注博來霉素法使之發生纖維化，最終建立氣虛血瘀型肺間質纖維化模型大鼠。并在造模后觀察肺系數、肺組織病理學HE、Masson染色來綜合評定模型是否成功。結果,氣虛血瘀PIF模型大鼠肺系數較空白組增高，但隨著纖維化程度的加重而逐漸降低，反應了纖維化疾病的發展規律；肺組織病理學變化是判斷造模是否成功的重要指標，HE染色可以將正常組織或病變組織的細胞成分的形態結構特點顯示出來[15]，而Masson染色可以反映組織中的纖維化程度，兩者結合可以直接反映肺纖維化的病理改變[16]。從染色結果來看,氣虛血瘀PIF模型組大鼠第7天炎癥反應明顯，而14天后纖維化逐漸加重。綜上，本次模型建立十分成功。

HGF、CTGF是纖維化病程中的兩個重要因子，具有相互拮抗又對立統一的關系。兩者結合點在TGF-β1，其中HGF能抑制纖維化發展，而CTGF則能促進纖維化的發展，正常情況下兩者處于動態平衡狀態。HGF通過抑制肌成纖維細胞中TGF-β1的產生來促進其凋亡的發生減輕肺纖維化，同時CTGF作為TGF-β1特異性下游介質，可與TGF-β1相互作用誘導肺成纖維細胞和Ⅱ型肺泡上皮細胞轉變成為肌成纖維細胞，減少細胞外基質的降解，使ECM沉積，最終導致肺纖維化。

本次實驗發現在正常大鼠中HGF與CTGF均有表達，但兩者表達處于平衡狀態，故未發生肺纖維化，在氣虛血瘀型PIF模型組大鼠中，HGF表達降低，CTGF表達增高，兩者動態平衡被破壞，發生肺纖維化，且隨著病程進展，CTGF表達逐漸上升，而HGF則逐漸下降，偏離平衡狀態愈來愈遠，病情則越發加重。

反向思考，以本實驗中氣虛血瘀模型為基點，使用益氣活血類中藥，以TGF-β1為切入點，發揮HGF的正向作用進而抑制肌成纖維細胞中TGF-β1的表達，或者削弱CTGF的促纖維化作用。若使兩者重新回歸平衡狀態，能否延緩或者控制纖維化病情的發展？即陰平陽秘，精神乃治。