原代小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)及尼古丁抑制腫瘤壞死因子α分泌的研究

劉菲 胡玉婷 劉靜 毛若穎 陶欣榮

摘要：目的? 本研究通過(guò)搖床法分離純化培養(yǎng)小鼠原代小膠質(zhì)細(xì)胞，并研究尼古丁對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞腫瘤壞死因子α（TNF-α ）的表達(dá)和分泌的影響。方法? 從C57 BL/6新生鼠大腦中分離出皮層，切碎研磨后進(jìn)行混合培養(yǎng)，搖床法分離純化小膠質(zhì)細(xì)胞并培養(yǎng)。CD11b、Iba1作為小膠質(zhì)細(xì)胞特異性標(biāo)記物用來(lái)檢測(cè)、鑒定小膠質(zhì)細(xì)胞，在激光共聚焦顯微鏡下觀察、計(jì)數(shù)免疫熒光細(xì)胞化學(xué)染色后的陽(yáng)性細(xì)胞。將純化的小膠質(zhì)細(xì)胞設(shè)置為三個(gè)組，分別為空白對(duì)照組，LPS組，LPS+NIC組。 LPS+NIC組先加入10 ug/ml LPS處理30 min，再加入10 μmol 尼古丁處理24 h。LPS組加入10 μg/ml LPS處理4 h。空白對(duì)照組不做任何處理。使用qPCR檢測(cè)尼古丁對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞TNF-α的表達(dá)，酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)檢測(cè)尼古丁對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞TNF-α分泌的影響。結(jié)果? 培養(yǎng)混合細(xì)胞，再通過(guò)搖床法收獲的小膠質(zhì)細(xì)胞，細(xì)胞陽(yáng)性率超過(guò)95.54%。免疫熒光細(xì)胞化學(xué)方法鑒定小膠質(zhì)細(xì)胞純度，小膠質(zhì)細(xì)胞特異性標(biāo)志物CD11b、Iba1，星形膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物GFAP檢測(cè)結(jié)果，ImageJ分析小膠質(zhì)細(xì)胞陽(yáng)性率>95.54%，星型膠質(zhì)細(xì)胞<4%，其它細(xì)胞<2%;LPS處理組與LPS+NIC處理組相比較，LPS+NIC組TNF-α的RNA水平的表達(dá)明顯降低，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;LPS單獨(dú)處理組，小膠質(zhì)細(xì)胞TNF-α分泌增加。而LPS+NIC組小膠質(zhì)細(xì)胞TNF-α分泌降低，兩組TNF-α分泌有明顯差異，且有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論? 利用差異貼壁，分離純化得到了高純度的小鼠原代小膠質(zhì)細(xì)胞，相較于其它方法，對(duì)細(xì)胞的損傷小，可多次收獲小膠質(zhì)細(xì)胞，細(xì)胞得率高。尼古丁可抑制小鼠原代小膠質(zhì)細(xì)胞TNF-α 的分泌，可能為神經(jīng)退行性疾病的治療提供新的治療方法。

關(guān)鍵詞：小膠質(zhì)細(xì)胞;原代培養(yǎng);尼古丁;腫瘤壞死因子

中圖分類號(hào)：R322.81? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?DOI：10.3969/j.issn.1006-1959.2019.02.031

文章編號(hào)：1006-1959（2019）02-0111-04

炎癥反應(yīng)（inflammatory reaction）是由先天免疫系統(tǒng)對(duì)抗內(nèi)源性和外源性的損傷形成身體的自衛(wèi)機(jī)制。小膠質(zhì)細(xì)胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中胚胎來(lái)源的自我更新組織的巨噬細(xì)胞，在大腦、脊髓、視網(wǎng)膜和嗅球中均有存在[1]。小膠質(zhì)細(xì)胞有多種功能，包括支持中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育和突觸形成、維持體內(nèi)平衡、對(duì)感染源的免疫反應(yīng)，以及參與成人神經(jīng)形成、神經(jīng)炎癥、退行性疾病、中風(fēng)、創(chuàng)傷和再生[2]。當(dāng)小膠質(zhì)細(xì)胞被激活后，往往伴隨神經(jīng)炎癥反應(yīng)的發(fā)生。這種神經(jīng)炎癥反應(yīng)可能通過(guò)清除神經(jīng)毒性因子起到神經(jīng)保護(hù)作用[3]，但它們也可能通過(guò)促炎介質(zhì)和氧化應(yīng)激水平升高導(dǎo)致神經(jīng)變性，以及神經(jīng)遞質(zhì)水平改變，而成為神經(jīng)毒性，致使神經(jīng)元死亡，記憶減少和海馬功能障礙[3-5]。已有證據(jù)顯示尼古丁在神經(jīng)退行性疾病的治療過(guò)程中可以產(chǎn)生有利的影響[6]。小膠質(zhì)細(xì)胞在調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)的內(nèi)源性神經(jīng)免疫機(jī)制中，起著重要作用。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)搖床法分離純化小膠質(zhì)細(xì)胞，并探索尼古丁對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞參與的炎癥反應(yīng)的作用。

1材料

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與儀器? 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物購(gòu)于常州卡維昂公司（許可證號(hào)SCXY（Su）2011-0003）6～8周SPF級(jí)C57 BL/6小鼠，雄性小鼠3只，雌性小鼠9只。離心機(jī)（平凡儀器，TDZ5-WS），搖床（DragonLAB，SK-D1807-E），細(xì)胞培養(yǎng)箱（ESCO，CCL-170B-8），顯微鏡（Leica），共聚焦顯微鏡（Olympus，F(xiàn)V1000）

1.2實(shí)驗(yàn)材料與試劑? 60×15 mm細(xì)胞培養(yǎng)皿（corning），六孔板（corning），25 m2細(xì)胞培養(yǎng)瓶（T-25 flask，Thermo）， 腔室載玻片（Lab-TekII Chamber Slide，8 wells），胎牛血清（FBS，Gibco），膠質(zhì)細(xì)胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基（DMEM /High glucose，HyClone），青霉素-鏈霉素（Penicillin/Streptomycin，Gibco），L-15條件培養(yǎng)基（Leibovitz's L-15 conditioned media），牛血清白蛋白（BSA），0.9%氯化鈉注射液，無(wú)水乙醇（上海試劑一廠），anti-Iba1 antibody（Wako;# 019-19741），anti-CD11b antibody（biolegend;#101201），anti-GFAP antibody（abcam;#ab7260）， 山羊抗兔IgG（H&L）二抗 （Alexa Fluor? 594;life technology），山羊抗大鼠IgG（H&L）二抗 （Alexa Fluor? 488;life technology）， 4'，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI，碧云天），免疫熒光防淬滅劑（碧云天）

2方法

2.1混合膠質(zhì)細(xì)胞的取材與培養(yǎng)? 喂養(yǎng)6～8周SPF級(jí)C57 BL/6小鼠，適應(yīng)2周，雌雄3∶1配對(duì)，待雌鼠懷孕后分籠。取材器械高壓滅菌，取雌鼠所生2～4 d新生鼠8只。放入75%酒精中浸泡消毒。取出小鼠，用剪刀剪斷小鼠頭部，并轉(zhuǎn)入75%酒精中再次消毒2 min，之后轉(zhuǎn)入0.9%氯化鈉注射液浸泡2 min，在60×15 mm平皿中加入 L-15（L-15+0.1%BSA+1%pen/strep）條件培養(yǎng)基，將浸泡在0.9%氯化鈉注射液中的小鼠腦轉(zhuǎn)入其中。剝離新生鼠腦膜，取出大腦皮層在新的L-15條件培養(yǎng)基中輕柔切碎組織，并轉(zhuǎn)入15 ml離心管，4℃，2000 r/min，離心5 min，棄去上清。所有實(shí)驗(yàn)步驟均需在冰上操作。用5～6 ml小膠質(zhì)細(xì)胞完全培養(yǎng)基（DMEM+10%FBS+1%pen/strep）重懸細(xì)胞，準(zhǔn)備5個(gè)T-25 flask，各加入已預(yù)熱（37℃）的小膠質(zhì)細(xì)胞完全培養(yǎng)基3 ml，將15 ml離心管中細(xì)胞上下吹打10次，并轉(zhuǎn)移至已準(zhǔn)備好的5個(gè)T-25 flask中，每瓶1 ml。5%CO2，37℃培養(yǎng)箱，培養(yǎng)5 d，全量換液，以后每隔3 d半量換液[7]。

2.2小膠質(zhì)細(xì)胞分離培養(yǎng)? Poly-L-Lysine（PLL）包被Lab-TekII Chamber Slide（8 wells）。混合細(xì)胞培養(yǎng)14 d后取出，用封口膜封閉培養(yǎng)瓶瓶蓋，置于搖床上，在100 rps ，37℃條件下?lián)u晃3 h。搖晃結(jié)束后吸取培養(yǎng)液，置于15 ml離心管中，4℃，2000 r/min，離心5 min。在原來(lái)的T-25 flask中仍加入小膠質(zhì)細(xì)胞完全培養(yǎng)基，放入培養(yǎng)箱，繼續(xù)培養(yǎng)（每瓶flask可進(jìn)行4～5次小膠質(zhì)細(xì)胞分離）。棄離心管中上層液體。用小膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)液重懸，種于已包被腔室載玻片及12孔板（5×106 ml-1）中。

2.3免疫熒光細(xì)胞化學(xué)染色? 實(shí)驗(yàn)孔中加入10 μg/ml LPS處理4 h。取種于腔室載玻片中的小膠質(zhì)細(xì)胞，PBS洗3次，每次5 min。放入4%多聚甲醛（PFA）對(duì)細(xì)胞進(jìn)行固定，20 min后用 PBS洗滌，每次5 min，共3次。0.1%聚乙二醇辛基苯基醚（TritonX-100）透膜處理5 min。棄去液體，將腔室載玻片置于濕盒內(nèi)，加入5%山羊血清，室溫封閉30 min。加入一抗CD11b（1∶200），Iba1（1∶500），GFAP（1∶500）置于濕盒，4℃過(guò)夜孵育。將腔室載玻片從濕盒中取出，復(fù)溫10 min。PBS洗3次，每次5 min。加入二抗Goat anti-Rat IgG H&L（1∶1000），Goat anti-rabbit IgG H&L（1∶1000）置于濕盒內(nèi)，室溫孵育30 min。PBS洗3次，每次5 min。DAPI（1∶2000）染核10 min。PBS洗3次，每次5 min，免疫熒光防淬滅劑封片，晾干后置于熒光顯微鏡觀察。

2.4尼古丁抑制激活狀態(tài)下小膠質(zhì)細(xì)胞TNF-α分泌

2.4.1尼古丁處理 設(shè)置三個(gè)組，分別為空白對(duì)照組，LPS組，LPS+NIC組。 LPS+NIC組先加入10 ug/ml LPS處理30 min，再加入10 μmol 尼古丁處理24 h。LPS組加入10 μg/ml LPS處理4 h。空白對(duì)照組不做任何處理。

2.4.2 qPCR檢測(cè)原代小膠質(zhì)細(xì)胞中TNF-α的表達(dá)? 從培養(yǎng)箱中取出6孔板（收集上清用于ElISA檢測(cè)），在已清空上清的12孔板中加入Trizol，提取細(xì)胞總RNA，測(cè)定RNA濃度。利用5X All-in-one RT master Mix（abm）試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，以GAPDH為內(nèi)參基因，Go Taq qPCR Master Mix試劑盒（Promega）測(cè)定不同組細(xì)胞TNF- 的RNA表達(dá)。TNF- 引物上游5'-TTGTCTACTCCCAGGTTCTCT-3'，下游5'-GAGGTTGACTTTCTCCTGGTATG-3'，GAPDH引物上游5'-GTGGGTGCAGCGAACTTTAT-3，下游5'-CACTGAGCATCTCCCTCACA-3'。設(shè)置條件95℃ 10 s，58℃ 60 s，40個(gè)循環(huán)。

2.4.3 ElISA檢測(cè)小膠質(zhì)細(xì)胞TNF-α的分泌? 收集細(xì)胞的上清液，放入離心機(jī)中，4℃，3000 r/min，離心20 min。ElISA試劑盒檢測(cè)小膠質(zhì)細(xì)胞TNF-α分泌。

2.5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理? 采用SPSS軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，非配對(duì)t檢驗(yàn)進(jìn)行分析，當(dāng)P<0.05時(shí)，認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3結(jié)果

3.1混合膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)? 混合膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)第6天，可看到少部分小膠質(zhì)細(xì)胞伸出突觸，多數(shù)為圓形，透光性較好的細(xì)胞（圖1A）。混合細(xì)胞培養(yǎng)14 d后細(xì)胞密度增加，出現(xiàn)分層，上層圓而亮的細(xì)胞，為小膠質(zhì)細(xì)胞，呈懸浮或半懸浮生長(zhǎng)，下層貼壁較緊的為星形膠質(zhì)細(xì)胞（圖1B）。經(jīng)搖床震蕩下的細(xì)胞重新鋪板后可發(fā)現(xiàn)細(xì)胞全部為亮圓的細(xì)胞，細(xì)胞多數(shù)懸浮于培養(yǎng)液中（圖1C）。細(xì)胞培養(yǎng)重新鋪板24 h后，可見(jiàn)細(xì)胞伸出突觸貼壁生長(zhǎng)（圖1D）。

3.2小膠質(zhì)細(xì)胞鑒定? 免疫熒光細(xì)胞化學(xué)方法鑒定小膠質(zhì)細(xì)胞純度，小膠質(zhì)細(xì)胞特異性標(biāo)志物CD11b、Iba1，星形膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物GFAP檢測(cè)結(jié)果，ImageJ分析小膠質(zhì)細(xì)胞陽(yáng)性率>95.54%（圖2A-B，2D），星型膠質(zhì)細(xì)胞<4%（圖2C，2D），其它細(xì)胞<2%（圖2D）。

3.3尼古丁處理小膠質(zhì)細(xì)胞? LPS處理組與LPS+NIC處理組相比較，LPS+NIC組TNF-α的RNA水平的表達(dá)明顯降低，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）（圖3）;LPS單獨(dú)處理組，小膠質(zhì)細(xì)胞TNF-α分泌增加。而LPS+NIC組小膠質(zhì)細(xì)胞TNF-α分泌降低，兩組TNF-α分泌有明顯差異，且有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）（圖4）。

4討論

小膠質(zhì)細(xì)胞占人類大腦5%～15%，作為腦內(nèi)的“監(jiān)視”細(xì)胞，參與各類替代修復(fù)反應(yīng)[6]。小膠質(zhì)細(xì)胞處于穩(wěn)態(tài)時(shí)（M0型），也會(huì)持續(xù)以其高能運(yùn)動(dòng)性影響中樞神經(jīng)系統(tǒng)。當(dāng)暴露于特定的生長(zhǎng)因子或細(xì)胞因子時(shí)，小膠質(zhì)細(xì)胞表型改變?yōu)榧せ顮顟B(tài)（M1型），這種表型長(zhǎng)期以來(lái)與神經(jīng)炎癥有關(guān)。在體外小膠質(zhì)細(xì)胞暴露于某些抗炎細(xì)胞因子后可以誘導(dǎo)產(chǎn)生另一種表型（M2型）[8]。因此建立一種體外培養(yǎng)較高產(chǎn)量的原代小膠質(zhì)細(xì)胞至關(guān)重要，它可提供足夠的細(xì)胞用于炎癥發(fā)生機(jī)制、藥物作用效果等的研究。原則上小膠質(zhì)細(xì)胞可以由大腦的任何一個(gè)部分培養(yǎng)而成，但是通過(guò)本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)大腦皮層培養(yǎng)的小膠質(zhì)細(xì)胞相較于全腦而言純度大大提高。在取材時(shí)，盡量少用或不用剪刀，細(xì)胞篩等，以減少帶來(lái)的物理傷害（本實(shí)驗(yàn)未用依然培養(yǎng)純度較高的小膠質(zhì)細(xì)胞）。腦內(nèi)的神經(jīng)元細(xì)胞與神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞互相影響[9]。因此，在混合細(xì)胞培養(yǎng)的前5 d，不需要換液并避免移動(dòng)細(xì)胞，讓各種神經(jīng)細(xì)胞在培養(yǎng)基中著床生長(zhǎng)。混合膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)14 d后，利用搖床，將上層貼壁較淺的小膠質(zhì)細(xì)胞通過(guò)物理方法分離，此方法分離純化的細(xì)胞數(shù)量與細(xì)胞純度較高。分離的小膠質(zhì)細(xì)胞在鋪板24 h后貼壁，并伸出突起。經(jīng)免疫熒光化學(xué)方法鑒定細(xì)胞純度在95%以上。

LPS 是一種免疫刺激劑，通過(guò)實(shí)驗(yàn)可以看出， LPS刺激小膠質(zhì)細(xì)胞后，小膠質(zhì)細(xì)胞腫瘤壞死因子TNF-α表達(dá)明顯增多。在神經(jīng)退行性疾病中可以看到小膠質(zhì)細(xì)胞迅速增殖并發(fā)生形態(tài)學(xué)改變，并且人類大腦組學(xué)研究表明，小膠質(zhì)細(xì)胞的這種變化是神經(jīng)退行性疾病表觀遺傳信號(hào)的重要組成部分[10]，因此找到抑制小膠質(zhì)細(xì)胞過(guò)度活化的方法是恢復(fù)神經(jīng)退行性疾病的重要靶點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)根據(jù)既往研究結(jié)果，在LPS激活的小膠質(zhì)細(xì)胞中加入尼古丁，可以看到小膠質(zhì)細(xì)胞TNF-α的表達(dá)降低。尼古丁通過(guò)調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)對(duì)機(jī)體能夠產(chǎn)生一些有利的影響，從而抑制炎癥反應(yīng)的發(fā)生。蛋白質(zhì)合成，翻譯后修飾和清除的機(jī)制（蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)）在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中失調(diào)是許多神經(jīng)退行性疾病的特征[11]。阿爾茨海默癥（AD）其病理學(xué)特征即表現(xiàn)為，蛋白穩(wěn)態(tài)喪失，導(dǎo)致β-淀粉樣蛋白（Aβ）沉淀，Tau蛋白異常磷酸化形成神經(jīng)元纖維纏結(jié)[12]。減少β-淀粉樣蛋白（Aβ）誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞的激活被認(rèn)為是有效治療阿爾茨海默癥（AD）的關(guān)鍵[13]，吸煙者帕金森病（PD）的患病率低于不吸煙者已被證明[14]，但尼古丁對(duì)神經(jīng)保護(hù)作用的機(jī)制尚不清楚。調(diào)節(jié)小膠質(zhì)細(xì)胞的激活，可能作為潛在治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病的一種手段[15]，因而尼古丁抑制小膠質(zhì)細(xì)胞激活對(duì)神經(jīng)元起到保護(hù)作用的機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

本研究借鑒現(xiàn)有小膠質(zhì)細(xì)胞純化培養(yǎng)、搖床分離差異貼壁神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的方法，建立高效純化小鼠原代小膠質(zhì)細(xì)胞的方法，并定量分析尼古丁對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞炎性因子TNF-α分泌的影響。為進(jìn)一步研究小膠質(zhì)細(xì)胞在炎癥反應(yīng)中的作用奠定基礎(chǔ)。

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收稿日期：2018-11-30;修回日期：2018-12-23

編輯/肖婷婷