力學因素對骨髓間充質干細胞成骨分化的影響

張麗 李曉陽 劉儻

摘要：近年來，組織工程學領域發展突飛猛進，已被列為一種修復或再生許多組織和器官的方法。骨髓間充質干細胞具有良好的成骨向分化潛能，在骨組織工程領域中具有廣闊的應用前景。骨髓間充質干細胞增殖和成骨向分化受多種力學因素的影響，且不同性質的力學刺激對其定向分化的調節作用不盡相同。目前，許多學者致力于深入探討力學因素影響骨髓間充質干細胞成骨向分化的具體途徑，但其調控機制尚未完全明確。本文綜述及討論力學因素對骨髓間充質干細胞所產生的增殖、定向成骨分化等生物學效應的影響及可能涉及的力化學信號轉導通路作用機制，以期豐富研究思路和理論依據。

關鍵詞：骨髓間充質干細胞;力學因素;骨向分化

中圖分類號：R329? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻標識碼：A? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?DOI：10.3969/j.issn.1006-1959.2019.02.012

文章編號：1006-1959（2019）02-0033-04

骨髓間充質干細胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）是一種來源于中胚層的原始祖細胞，是骨髓中具有自我更新和多向分化潛能的干細胞。BMSCs取材便易、易于分離培養，具有較強的分化潛能，在一定的體內外條件下可使其定向分化為成骨細胞、軟骨細胞、脂肪細胞、神經細胞等不同的組織細胞。由于其具有諸多優點，因而受到研究者們的青睞，被當作理想的組織工程學種子細胞和細胞治療、基因治療的靶細胞，在臨床治療創傷后骨不連、成骨不全、退行性骨關節疾病、骨質疏松、中樞神經系統病變等許多疾病方面具有良好的應用前景。影響BMSCs成骨向分化的因素主要包括化學因素和物理因素，一般認為激素、生長因子、細胞因子、趨化因子等組成的化學信號轉導通路形成的復雜網絡調控BMSCs的增殖分化，但是近年來，許多研究表明[1-3]，適當的物理因素，如：力學因素、電磁場、體外震波、熱處理、激光、超聲等在BMSCs成骨向分化過程中也發揮著不可忽視的作用。力學因素存在于一切細胞微環境中，是調節BMSCs生物學行為的一種重要途徑。BMSCs是現代醫學和生物學的研究熱點，通過比較不同力學因素對BMSCs生物學效應的影響，達到最優的定向分化效果，具有重要的醫學研究意義。本文就目前常用的不同性質、大小、頻率、施加方式、作用時間的力學因素對BMSCs成骨向分化影響的相關研究進行綜述，以期豐富研究思路和理論依據。目前常用的研究影響BMSCs成骨向分化的力學因素主要有壓應力、牽張應力、剪切應力和重力等。

1壓應力對BMSCs成骨向分化的影響

壓應力模型將細胞培養于密閉容器中，通常利用氣體或流體作為傳導基質，通過抽吸成真空的方式產生負壓，使培養環境內的細胞受壓;也可以通過向密閉的培養腔內注入二氧化碳、空氣、氮氣等方式產生正性壓力使細胞受壓;還可以通過液柱產生正性靜壓力使細胞受壓。其優點是裝置設備簡單，細胞受力均勻，載荷易于傳遞且不依賴培養物與基質的結合狀態，容易實現。Huang C等[1]將BMSCs植入羥基磷灰石支架，予以循環靜水壓的自動生物處理器中孵育3周，結果發現骨鈣素、骨橋蛋白、骨連接蛋白和1型膠原水平增高。靜水壓顯著增強細胞活力，促進成骨分化和成熟。Stavenschi E等[2]對BMSCs施加幅度為10 kPa、100 kPa、300 kPa，頻率為0.5 Hz、1 Hz、2 Hz的循環靜水壓，結果發現且循環靜水壓誘導BMSCs早期成骨反應呈幅度和頻率依賴性，最強烈的促成骨反應出現在最高值（300 kPa）和頻率（2 Hz）。姜喜亮等[3]通過對BMSCs施加適當的壓力后提取RNA及蛋白，檢測重要信號分子FAK、整合素β1（integrinβ1）和整合素連接激酶（integrin-linked kinase，ILK）的表達，發現整合素信號通路參與細胞力學信號向生物化學信號的轉化，在靜水壓力誘導細胞骨架結構改變中的發揮一定作用。同時， 骨保護素（osteoprotegerin，OPG）及其配體（receptor activator of NFκB ligand，RANKL）在骨改建中具有重要作用。Liu J等[4]對體外分離培養的大鼠BMSCs施加靜態或動態壓應力刺激，采用實時定量RT-PCR檢測分析BRANKL和OPG mRNA水平，結果表明，在BMSCs成骨向分化的早期階段無論暴露于靜態或動態壓應力均促進破骨效應，RANKL/OPG表達上調。在成骨向分化的不同時期BMSCs對壓應力顯示不同反應。在無壓應力刺激成骨誘導BMSCs的早期階段RANKL/OPG明顯升高，提示了骨重塑對機械刺激早期生物學反應的新機制。因此，適當的壓應力可以促進BMSCs增殖和多向分化，一定的壓應力刺激可能是通過復雜的信號轉導通路調控BMSCs分化，但是具體的調節機制目前尚不完全明確，還需要不斷的探索研究。

2牽張應力對BMSCs成骨向分化的影響

組織細胞常受到動態牽拉應力作用，體內牽拉應力通過細胞外基質傳遞到細胞。牽張應力是研究較早，目前研究較為成熟的一種力學因素。牽張應力模型利用液體或氣體對彈性基底膜施加可控位移或壓力作用，使細胞基底膜產生彈性變化從而影響粘附于膜上的細胞受到相應的牽張應力作用。目前常用的加載系統有四點彎曲、軸向牽拉（單軸、雙軸）、真空作用模型，其中最為人所熟知的是Flexercell加載系統[5]。力學刺激的不同方式對BMSCs分化產生的效果并不相同。在成骨分化過程中，間歇施加周期性牽拉應力和連續施加周期性牽拉應力對BMSCs成骨向分化的影響是不同的。Grier WG等[6]使用自設計的循環拉伸應變生物反應器施加周期性和持續性牽拉應力刺激人BMSCs，試驗顯示，間歇施加周期性牽拉應力（1 Hz，每6 h 10 min）對BMSCs的成骨向分化起到促進作用。代慶剛等[7]對大鼠BMSCs進行體外實驗，結果顯示，5%、10%、15%的持續牽張應力均可更有效地促進BMSCs的成骨向分化，但10%的持續牽張應力的促進效應更顯著。持續牽張應力作用下BMSCs細胞形態呈現一定規律性排列，其增殖活性受到抑制，但早期成骨向分化能力卻顯著提高[8]。由此可見，牽張應力對BMSCs增殖和細胞骨架的排列等生物學效應產生重要作用。同時，牽張應力可增強骨形態發生蛋白9（bone morphogenetic protein 9，BMP9）誘導的成骨作用。Song Y等[9]的研究顯示，牽張應力誘導細胞骨架重組并通過阻滯細胞進入細胞周期的S期來抑制細胞增值，促進成骨分化。

BMSCs成骨向分化過程中，不同形式的牽張應力對BMSCs增殖、成骨向分化的影響不同，間歇施加周期性牽拉應力促進BMSCs的成骨向分化，且牽張應力對BMSCs的影響存在于適當的范圍，適宜的牽張應力通過復雜的作用機制促進BMSCs增殖、細胞形態、骨架排列、成骨向分化等一系列生物學行為。

3剪切應力對BMSCs成骨向分化的影響

正常人體內各類骨組織細胞持續暴露于荷載狀態下由于組織間隙內液體流動造成的剪切應力中。根據流變學原理建立流動小室，模擬體內流體環境，利用流動培養液對附著于培養基質上的細胞產生剪切應力，保證細胞在受到不同水平恒流或生理剪切應力的作用下仍保持與基質粘附。目前國內外廣泛使用的研究流體剪切應力對細胞影響的儀器主要為錐板流動室、平行平板流動室、板板流室、圓柱管流室和徑向流裝置等。其中平行平板流動室其流室體積小，便于實時觀察、顯示和標記，操作簡單快捷，能實現自動化控制的優點而成為最常用的操作模式。試驗顯示流體剪切應力能夠提高人BMSCs細胞增殖能力，增強細胞活性， 且與流體剪切應力的模式相關。Liu L等[10]對人BMSCs實加間歇性和連續性流體剪切力刺激，發現前者較后者能更好的誘導成骨分化。Vetsch JR等[11]對人BMSCs實加不同流速的剪切力，發現高流速（0.061 m/s）、高剪切力（0.55～24 mPa）可顯著增強成骨分化。Hu K等[12]發現流體剪切應力作用下的成骨細胞，通過激活TRPV 4通道使Ca2+內流促進核心結合因子Cbfα1的表達，從而誘導人BMSCs增殖。Becquart P等[13]研究顯示剪切應力可通過激活ERK1/2信號通路促進BMSCs成骨向分化，其作用較壓應力更有效。可以看出，利用剪切應力加載系統模型模擬體內流體環境，可以促進BMSCs增殖和成骨向分化，其發揮效應依賴于施加應力大小和作用時間。剪切應力影響BMSCs生物活性的機制復雜，可能是通過一定的信號轉導通路實現。

4微重力和離心力對BMSCs成骨向分化的影響

微重力影響BMSCs增殖和細胞骨架。李煜等[14]應用旋轉細胞培養系統對小鼠BMSCs模擬微重力條件下行成骨誘導，培養10 d，檢測堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）及與成骨相關的基因蛋白COLI、Runx-2，結果發現微重力條件能明顯抑制成骨相關蛋白的表達。微重力條件可促進BMSCs增殖，抑制BMSCs向成骨細胞的分化。細胞微絲骨架對微重力敏感，Mao XL等[15]利用恒溫器模擬微重力施加于BMSCs，發現微重力通過重塑F-肌動蛋白和增加細胞硬度來抑制BMSCs的遷移。Li L等[16]在正常地面重力和模擬微重力下，將hBMSCs在成骨誘導0、2、7和14 d，然后通過RNA測序分析發現微重力抑制BMSCs 增殖并抑制成骨分化，但促進脂肪形成。此外，微重力還延長高致瘤性細胞存活。楊先炯等[17]采用平行平板旋轉培養裝置模擬微重力效應，結果發現Wnt3a/β-catenin信號通路可能介導了微重力效應誘導的BMSCs增殖抑制。

在BMSCs向成骨細胞分化過程中，離心力是一種促進因素。蔣斌等[18]對BMSCs實施不同大小的離心力，結果發現較低轉速（200 r/min與500 r/min）的離心力可促進BMSCs增殖，其中500 r/mmin干預5 d（相對離心力大小約為30.9 g）的促進作用最強。而過高轉速（800 r/min，相對離心力大小約為79.2 g）的離心力表現為抑制作用。段峰等[19]給予成骨細胞不同轉速離心力（90 r/min，180 r/min，250 r/min）和相同轉速不同持續時間（6 h、12 h、24 h）的刺激，顯示離心力刺激可促進成骨細胞骨形態發生蛋白信號通路中Runx-2mRNA 的表達，且都隨時間延長差異明顯，其中180 r/min組（旋轉半徑19 cm，相對離心力大小約為6.8 g）作用最強。

當機體處于特殊的微重力環境，其自身重力消失，骨細胞缺乏必要的機械應力刺激作用，BMSCs增殖明顯減慢，成骨細胞特異性基因的表達受到抑制，而脂肪細胞特異性基因的表達上升，模擬微重力通過Wnt3a/β-catenin細胞信號通路來抑制成骨細胞分化和促進脂肪細胞分化。離心力能夠促進BMSCs成骨向分化。

骨髓間充質干細胞具有多向分化潛能， 在組織工程研究和多種疾病的臨床治療中被寄予厚望，具有重要的科研和臨床應用價值，探討BMSCs定向增殖和分化的最佳誘導條件一直是國內外研究的熱點。力學刺激是一種影響BMSCs細胞結構和功能的重要外界因素。不同性質的應力以及應力的大小、頻率、施加方式、作用時間等力因素影響BMSCs增殖、周期、骨架和分化等生物學行為。應用各種力學裝置系統研究力學因素調節BMSCs生物學效應的一系列實驗表明，利用適當的機械力學因素結合各種促分化化學誘導因子能促進BMSCs成骨向分化，這對組織工程具有深遠的意義，同時也為臨床應用力學刺激進行治療提供必要的理論依據。BMSCs成骨向分化過程相關的細胞信號轉導通路和功能調控機制的研究已取得許多重要進展，但力學刺激誘導BMSCs成骨向分化的力學信號轉導途徑和機制還尚未完全明確。與此同時，如何更加科學有效地對BMSCs進行力學加載，尋找最佳力學刺激條件等一些有關力學因素影響BMSCs成骨向分化的問題也亟待解決，這些是今后誘導BMSCs成骨向分化研究領域的重要內容，尚需進一步的探索。

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收稿日期：2018-11-1;修回日期：2018-11-12

編輯/楊倩