利福平膠囊的微生物限度檢查方法的研究

董自艷 易大為 張亞杰

(1 遼寧省撫順市藥品檢驗檢測中心，撫順 113006；2 遼寧省藥品檢驗檢測院，沈陽 110035)

利福平(rifampicin)是利福霉素B的一種衍生物，其抗菌力強、抗菌譜廣、能低濃度抑菌和高濃度殺菌。它對結核桿菌、多數革蘭陽性菌有強大快速的抗菌作用，對麻風桿菌、某些革蘭陰性菌有抑菌作用[1]。利福平為紅色或暗紅色的結晶狀粉末，不溶于水。一般制成膠囊或片劑的口服藥，與其他抗結核藥合用起協同作用。主要用于治療結核病、腦膜炎和金黃色葡萄球菌感染，外用可治療沙眼等[2]。

利福平的抑菌活性很強，2015年版中國藥典強調的方法學適用性試驗更顯重要性，只有采用適宜方法去除抑菌活性，才有可能檢出藥品中污染的微生物，避免檢驗結果假陰性，從而保證微生物限度檢查方法的科學性，以有效控制藥品質量[3]。而文獻中雖有滴眼用利福平的微生物限度檢查方法的報道，卻未見利福平膠囊微生物限度檢查方法的報道[4-5]，而且滴眼用利福平的微生物限度檢查方法與本文所建立的利福平膠囊微生物限度檢查方法的差異很大?；诖?，本文按照2015版中國藥典四部非無菌產品微生物限度檢查方法的要求，對利福平膠囊進行方法學適用性試驗，建立的微生物限度檢查方法，對同類藥品的微生物學檢驗具有一定的指導意義，具體研究如下。

1 材料

1.1 供試樣品

利福平膠囊，規格：0.3g，批號：1708031、1708032和1708033，某藥廠生產。

1.2 儀器

JJ1000型分析天平(江蘇常熟雙杰測試儀器廠)；DK-98-IIA型電熱恒溫水浴鍋(天津泰斯特儀器有限公司)；HFSAFE-1500型生物安全柜(上海力申科學儀器有限公司)；SHB-ⅢA型循環水式多用真空泵(鄭州長城科工貿有限公司)；GN-6 Metricel Grid濾膜及濾器(Pall corporation)；KB240型培養箱(Binder公司)；SX-700高壓滅菌器[Tomy. Kogyo.(日本)]。

1.3 菌種

枯草芽孢桿菌[CMCC(B)63501]、金黃色葡萄球菌[CMCC(B)26003]、銅綠假單胞菌[CMCC(B)10 104]、大腸埃希菌[CMCC(B)44 102 ]、白念珠菌[CMCC(F)98001]、黑曲霉[CMCC(F)98003]均由中國食品藥品檢定研究院提供。

1.4 試劑

吐溫80(國藥集團化學試劑有限公司，批號20151105)；十四烷酸異丙酯(國藥集團化學試劑有限公司，批號：20121122)；氯化鈉(國藥集團化學試劑有限公司，批號：10019318)。

1.5 培養基

胰酪大豆胨液體培養基(TSA)(廣東環凱微生物科技有限公司，批號：1063865)；胰酪大豆胨瓊脂培養基(美國Merck公司，批號：VM740758622)；沙氏葡萄糖液體培養基(SDB)(美國Merck公司，批號：VM682839518)；沙氏葡萄糖瓊脂培養基(SDA)(廣東環凱微生物科技有限公司，批號：3304005)；pH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液(北京陸橋技術股份有限公司，批號：151010)；麥康凱液體培養基(廣東環凱微生物科技有限公司，批號：1064485)；麥康凱瓊脂培養基(廣東環凱微生物科技有限公司，批號：3302132)，均為成品培養基，使用前均進行培養基適用性檢查，均符合規定。

2 方法與結果

2.1 菌液的制備

取金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、白念珠菌的新鮮培養物適量，用0.9%無菌氯化鈉溶液制成含菌數約為103～104CFU/mL，備用。取經培養7d的黑曲霉斜面培養物，加5mL含0.05%(mL/mL)吐溫80的0.9%無菌氯化鈉溶液洗下霉菌孢子，作為原液；取霉菌孢子懸液倍量稀釋至霉菌數約為103～104CFU/mL，備用。取大腸埃希菌的新鮮培養物適量，用0.9%無菌氯化鈉溶液制成含菌數約為10～102CFU/mL，備用。

2.2 供試液制備

2.2.1 油性供試液的制備

取供試品10g，無菌操作開啟膠囊殼，傾出內容物置無菌錐形瓶中，膠囊殼置無菌乳缽中。取2mL pH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液注入無菌乳缽中，置于44℃水浴上研磨，使膠囊殼軟化至泥狀，將軟化的膠囊殼投入裝有利福平內容物的無菌錐形瓶中，加滅菌十四烷酸異丙酯至100mL，繼續在44℃水浴上保溫并振搖，使成均一混懸液，作為油性供試液。

2.2.2 水性供試液的制備

取“2.2.1”項下油性供試液50mL(相當于利福平膠囊5g)，置于500mL無菌輸液瓶中加pH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液100mL，密封，充分振搖1min，倒置、分層，用無菌注射器取水層，置于無菌錐形瓶中，取上清液，作為1:20供試液。取1:20供試液5mL，加pH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液45mL，作為1:200供試液。

2.3 微生物計數法適用性試驗

2.3.1 需氧菌總數計數方法

(1)稀釋法：取1:20供試液9.9mL 5份，分別加入5種試驗菌0.1mL(含菌量約104CFU/mL)，混勻。立即分別取1mL注入平皿，傾注TSA培養基。按平皿傾注法測定其菌落數。同法測定供試品對照組及菌液對照組菌數。(2)稀釋法結合薄膜過濾法：用適量沖洗液將無菌濾膜濕潤。取1:200供試液1mL，經薄膜過濾，用保溫至44℃的含0.1%吐溫80的pH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液1000mL沖洗濾膜濾器，每次沖洗量為100mL，在最后一次沖洗液中加入小于100CFU試驗菌(銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌)，每個試驗菌各制備1張濾膜，菌面朝上貼于TSA平板上。同法測定供試品對照組及菌液對照組菌數。

2.3.2 霉菌和酵母菌總數計數方法(稀釋法)

取1:20供試液9.9mL 2份，分別加入白念珠菌和黑曲霉0.1mL(含菌量約104CFU/mL)，混勻。立即分別取1mL注入平皿，傾注SDA培養基。按平皿傾注法測定其菌落數。同法測定供試品對照組及菌液對照組菌數。

2.3.3 回收比值測定

試驗組：分別按上述菌落計數方法進行試驗組菌落的計數。菌液對照組：以稀釋劑替代供試品溶液，按照試驗組的菌落計數方法試驗。供試液對照組：按菌落計數方法，不加試驗菌，測定供試品本底菌數。中和劑對照組：取相應量稀釋液替代供試品同試驗組操作?；厥毡戎涤嬎悖褐泻蛣┙M回收比值為中和劑對照組菌落數與菌液對照組菌落數的比值，試驗組回收比值為試驗組菌落數減去供試品對照組菌落數與菌液對照組菌落數的比值。

2.4 控制菌(大腸埃希菌)檢查方法驗證試驗

用適量沖洗液將無菌濾膜濕潤，取1:20供試液20mL，加pH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液至50mL，經薄膜過濾，用pH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液500mL，沖洗濾膜濾器，每次沖洗量為100mL，在最后一次沖洗液中加入小于100CFU大腸埃希菌，將濾膜投入至TSB培養基100mL中，依相應大腸埃希菌的控制菌檢查法在規定溫度和時間下培養，進行檢查。

2.5 陰性對照試驗

以上計數方法及控制菌檢查方法，在不加供試品和試驗菌的情況下，以稀釋劑替代供試品按相應微生物計數方法和控制菌檢查法進行檢測。

2.6 結果

2.6.1 稀釋法(1:20)

結合平皿傾注法的微生物計數方法驗證試驗結果，按稀釋法(1:20)結合平皿傾注法的方法驗證試驗結果見表1。結果表明：經3次獨立平行試驗，銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌的菌回收比值均低于0.5，白念珠菌和黑曲霉的菌回收比值均高于0.5。稀釋法(1:20)結合平皿傾注法可用于霉菌和酵母菌總數測定，不適用于本品的需氧菌總數測定。

2.6.2 稀釋法(1:200)

結合薄膜過濾法微生物計數方法驗證試驗結果，測定結果見表2。結果表明：經3次獨立平行試驗，銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌菌回收比值高于0.5，該方法可用于本品的需氧菌總數測定。

2.6.3 控制菌方法驗證試驗結果

控制菌按薄膜過濾法檢查的驗證試驗結果見表3。結果表明：采用薄膜過濾法進行大腸埃希菌檢驗，陽性對照菌均檢出，所有陰性對照試驗均無菌生長。

表1 稀釋法(1:20)結合平皿傾注法的計數及回收比值測定結果(n=3)Tab. 1 The counting and recovery of dilution method combined with routine method (n=3)

表3 控制菌按薄膜過濾法檢查的方法驗證試驗結果(n=3)Tab. 3 Verification test results of control bacteria by membrane filtration method (n=3)

2.7 供試品微生物限度檢查及控制菌檢查

采用上述確定的檢查方法對3批樣品進行微生物限度檢查和控制菌檢查，結果需氧菌總數小于200CFU/g，霉菌和酵母菌總數小于200CFU/g，均未檢出大腸埃希菌，符合2015年版中國藥典口服制劑的微生物限度標準，具體結果表4。

表4 3批樣品的微生物限度檢查結果Tab. 4 Results of microbial limit test of three batches of samples

3 討論

(1)供試液的制備方法：利福平膠囊抑菌活性很強，直接接種法、培養基稀釋法、用pH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液溶解的1:1000供試液進行薄膜過濾法都不能去除其抑菌性，細菌的回收比值均無法達到要求。本文改善了供試品的處理方法，沖洗液沖洗體積也做了調整，采用十四烷酸異丙酯分散成混懸液，再用pH7.0氯化鈉-蛋白緩沖液萃取后，采用稀釋法結合薄膜過濾法可解決這個問題。

(2)沖洗量的確定：通過反復試驗發現，利福平對細菌抑制活性最強，對真菌和酵母菌抑制活性較弱，因此需氧菌計數的沖洗量采用1000mL，真菌和酵母菌采用常規法計數，控制菌大腸埃希菌沖洗量為500mL，即能達到實驗要求。

(3)沖洗液的溫度和吐溫80的含量：利福平為脂溶性抗生素，薄膜過濾時易吸附殘留于濾膜上，沖洗不干凈，即使濃度低，也抑制部分陽性試驗菌的生長。因此本文采用的是含0.1%聚山梨酯80的pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液作為沖洗液，沖洗液用44℃水浴保溫，可增加沖洗液和供試液的濾過性。