HPLC法測(cè)定頭孢氨芐原料及膠囊中的有關(guān)物質(zhì)

鐘瑩 陳紅英 王健松

(廣州白云山醫(yī)藥集團(tuán)股份有限公司白云山制藥總廠，廣州 510515)

頭孢氨芐為β-內(nèi)酰胺類抗生素，耐酸，口服吸收良好[1]。臨床上用于敏感菌所致的急性扁桃體炎、咽頰炎、中耳炎、鼻竇炎、支氣管炎、肺炎等呼吸道感染、尿路感染及皮膚軟組織感染等，其在生產(chǎn)過(guò)程中可能存在α-苯甘氨酸(雜質(zhì)A)、7-氨基去乙酰氧基頭孢烷酸(雜質(zhì)B)和Δ-2-頭孢氨芐(雜質(zhì)F)等[2]雜質(zhì)。2015年版中國(guó)藥典中該品種原料和膠囊有關(guān)物質(zhì)測(cè)定方法采用高效液相色譜法[3]，但發(fā)現(xiàn)使用該法頭孢氨芐與其同分異構(gòu)體Δ-2-頭孢氨芐難達(dá)到有效分離，并且流動(dòng)相中磷酸二氫鉀溶液的濃度較高。本文對(duì)方法進(jìn)行了研究和改進(jìn)，可使各雜質(zhì)峰得到有效分離和檢出，更好保障產(chǎn)品質(zhì)量。

1 儀器與試藥

1200高效液相色譜儀(DAD檢測(cè)器，Agilent公司)，1260高效液相色譜儀(DAD檢測(cè)器，Agilent公司)，CPA225D十萬(wàn)分之一電子天平(德國(guó)Sartorius公司)。

頭孢氨芐(廠家A，批號(hào)：00167)，頭孢氨芐膠囊(廠家B，規(guī)格0.125g，批號(hào)：2170501、2170601、2170602)，頭孢氨芐對(duì)照品(中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：130408-201410，89.0%)，雜質(zhì)對(duì)照品：雜質(zhì)A(α-苯甘氨酸，中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：130415-200904，98.5%)。雜質(zhì)B(7-氨基去乙酰氧基頭孢烷酸，中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：130416-201006，94.4%)，雜質(zhì)F(Δ-2-頭孢氨芐，TRC，批號(hào)：6-RNP-168-2，95%)，甲醇(色譜純，美國(guó)Merk公司)，其他試劑均為分析純，水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

2.1.1 色譜條件

色譜柱Thermo Hypersil GOLD，C18(4.6mm×100mm, 3μm)；流動(dòng)相：流動(dòng)相A為0.05mol/L磷酸二氫鈉溶液(用氫氧化鈉試液調(diào)節(jié)pH值至5.0)，流動(dòng)相B為甲醇，梯度洗脫(0～20min，A：95%→55%；20～37min，A：55%→95%；37～40min，A保持95%)；檢測(cè)波長(zhǎng)220nm；流速為1mL/min；進(jìn)樣量20μL。

2.1.2 系統(tǒng)適用性

取頭孢氨芐，雜質(zhì)A、B和F對(duì)照品適量加pH7.0磷酸鹽緩沖液適量超聲使溶解，加流動(dòng)相A稀釋制成各含10μg/mL的混合溶液，作為系統(tǒng)適用性溶液。記錄色譜圖，見(jiàn)圖1，頭孢氨芐峰理論塔板數(shù)為55968，雜質(zhì)A與雜質(zhì)B的分離度為1.8，頭孢氨芐與雜質(zhì)F的分離度為10.4。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對(duì)照品溶液

取雜質(zhì)A、雜質(zhì)B和雜質(zhì)F對(duì)照品各約10mg，精密稱定，置于同一100mL量瓶中，加pH7.0磷酸鹽緩沖液約20mL超聲使溶解，再用流動(dòng)相A稀釋至刻度，搖勻，精密量取2mL，置于20mL量瓶中，用流動(dòng)相A稀釋至刻度，搖勻，作為雜質(zhì)對(duì)照品溶液。

圖1 系統(tǒng)適用性HPLC色譜圖Fig. 1 HPLC chromatogram of system suitability

2.2.2 供試品溶液

分別取樣品適量，精密稱定，用流動(dòng)相A溶解并稀釋制成含頭孢氨芐1.0mg/mL的溶液，作為供試品溶液。

2.2.3 自身對(duì)照溶液

精密量取供試品溶液1mL，置于100mL量瓶中，用流動(dòng)相A稀釋至刻度，搖勻，作為對(duì)照溶液。

2.3 測(cè)定法

精密量取供試品溶液、對(duì)照溶液與雜質(zhì)對(duì)照品溶液各20μL，分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖。供試品溶液色譜圖中如有雜質(zhì)峰，雜質(zhì)A、B和F按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算；其他單個(gè)雜質(zhì)按自身對(duì)照法計(jì)算(圖2)。

圖2 供試品溶液的HPLC色譜圖Fig. 2 HPLC chromatogram of sample

2.4 與中國(guó)藥典2015年版方法比較

2.4.1 色譜條件

采用歐洲藥典和中國(guó)藥典方法，結(jié)果頭孢氨芐和雜質(zhì)F分離度分別為0.87和1.15，均未達(dá)到基本分離(圖3)。為提高頭孢氨芐和雜質(zhì)F的分離度，流動(dòng)相組成選擇濃度低的鹽溶劑(0.05mol/L pH5.0磷酸二氫鈉溶液-甲醇)，選用粒徑小的色譜柱，并優(yōu)化了流動(dòng)相梯度洗脫條件。結(jié)果各峰分離效果好，分析時(shí)間合適(圖1)。

2.4.2 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

中國(guó)藥典系統(tǒng)適用性要求為：供試品溶液80℃破壞60min后，頭孢氨芐與相鄰峰分離度應(yīng)大于1.5。但破壞程度超過(guò)20%，產(chǎn)生的雜質(zhì)峰較多，采用中國(guó)藥典2015年版色譜條件，頭孢氨芐與前后相鄰雜質(zhì)峰的分離度為3.04和1.66，但其他降解雜質(zhì)峰之間分離度較差(圖4)。采用優(yōu)化后方法，頭孢氨芐與前后相鄰雜質(zhì)峰的分離度為2.55和2.09，其他降解雜質(zhì)峰之間分離度良好，說(shuō)明方法可使降解雜質(zhì)峰得到有效分離和檢出(圖5)。因破壞條件過(guò)于劇烈，系統(tǒng)適用性試驗(yàn)改為考察雜質(zhì)A和B，頭孢氨芐和雜質(zhì)F的分離度更為合理，具體見(jiàn)“2.1.2”項(xiàng)。

2.4.3 樣品測(cè)定

分別采用本實(shí)驗(yàn)方法和中國(guó)藥典2015年版方法，對(duì)原料、膠囊以及在25℃/75%相對(duì)濕度(RH)條件下放置10d的原料進(jìn)行對(duì)比檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)表1～2。結(jié)果本實(shí)驗(yàn)方法能有效檢出雜質(zhì)F，且檢出的雜質(zhì)個(gè)數(shù)更多，見(jiàn)圖6～7，有助于發(fā)現(xiàn)產(chǎn)品中的質(zhì)量問(wèn)題，促使產(chǎn)品質(zhì)量的提高。

圖3 雜質(zhì)F和頭孢氨芐HPLC色譜圖Fig. 3 HPLC chromatograms of impurity F and cephalexin

圖4 供試品溶液80℃破壞60min HPLC色譜圖Fig. 4 HPLC chromatogram of sample placed under 80℃ for 60min

圖5 供試品溶液80℃破壞60min HPLC色譜圖—優(yōu)化后方法Fig. 5 HPLC chromatogram of sample placed under 80℃ for 60min—optimized method

3 方法學(xué)驗(yàn)證

3.1 專屬性

3.1.1 空白干擾試驗(yàn)

稱取空白輔料(相當(dāng)于0.125g規(guī)格一粒的量)置100mL量瓶中，加流動(dòng)相A稀釋至刻度，搖勻，濾過(guò)，精密量取20μL注入液相色譜儀，結(jié)果空白輔料無(wú)干擾。

3.1.2 強(qiáng)制破壞性試驗(yàn)(表3)

取原料及膠囊分別用1mol/L鹽酸溶液、1mol/L氫氧化鈉溶液、3%過(guò)氧化氫和高溫60℃、光照等苛刻條件進(jìn)行破壞試驗(yàn)后，按上述色譜條件進(jìn)行檢測(cè)。

結(jié)果表明空白溶劑對(duì)測(cè)定無(wú)干擾，在各種破壞條件下所得的降解產(chǎn)物峰與主成分峰分離良好，降解產(chǎn)物峰之間也具有良好的分離度，各條件下主峰純度因子均大于990。通過(guò)比較試驗(yàn)前后總峰面積的變化，物料平衡(A破壞后總峰面積/A破壞前總峰面積×100%)在90%～110%，方法具有專屬性。雜質(zhì)A和雜質(zhì)B在各條件下均較穩(wěn)定，雜質(zhì)F在堿性條件下稍增加。

3.2 其他驗(yàn)證項(xiàng)目

對(duì)本實(shí)驗(yàn)方法的定量限、檢測(cè)限、準(zhǔn)確度、重復(fù)性和溶液穩(wěn)定性等進(jìn)行了研究，見(jiàn)表4，結(jié)果方法的靈敏度、精密度和準(zhǔn)確度等都較好，方法科學(xué)、合理、可行，適用于頭孢氨芐原料及膠囊有關(guān)物質(zhì)檢測(cè)。

4 討論

中國(guó)藥典2015年版頭孢氨芐原料及膠囊有關(guān)物質(zhì)測(cè)定方法中流動(dòng)相組成為0.2mol/L磷酸二氫鈉溶液(pH5.0)-甲醇，在此條件下頭孢氨芐與雜質(zhì)F分離度為1.15，未能達(dá)到基本分離，且流動(dòng)相中磷酸二氫鈉的濃度較高，易析出晶體，阻塞色譜柱，系統(tǒng)適用性試驗(yàn)對(duì)供試品溶液破壞程度過(guò)于劇烈。本法參考?xì)W洲藥典9.4[2]頭孢氨芐原料有關(guān)物質(zhì)測(cè)定方法，降低磷酸二氫鈉溶液的濃度，篩選了合適的色譜柱，并優(yōu)化了梯度洗脫條件，不但主峰及雜質(zhì)峰出峰時(shí)間適宜，并能有效地分離各個(gè)雜質(zhì)峰。經(jīng)破壞后的降解產(chǎn)物在此色譜條件下也能有效地與主峰完全分離，具良好的專屬性。

雜質(zhì)A和雜質(zhì)B穩(wěn)定，在強(qiáng)制降解試驗(yàn)和穩(wěn)定性中均未見(jiàn)增長(zhǎng)。雜質(zhì)F為頭孢氨芐的同分異構(gòu)體，在堿性條件下稍增加，在穩(wěn)定性放置過(guò)程中會(huì)增加。方法中以雜質(zhì)對(duì)照品外標(biāo)法檢測(cè)這3個(gè)特定雜質(zhì)的量，能較好地分析各雜質(zhì)在穩(wěn)定性放置過(guò)程中的變化趨勢(shì)，有助于發(fā)現(xiàn)產(chǎn)品中的質(zhì)量問(wèn)題，促使產(chǎn)品質(zhì)量的提高。

采用本方法分別對(duì)頭孢氨芐原料及膠囊進(jìn)行有關(guān)物質(zhì)檢測(cè)，方法的適用性良好，并將結(jié)果與中國(guó)藥典2015年版測(cè)定結(jié)果比較，具有更強(qiáng)的分析雜質(zhì)的能力。本方法簡(jiǎn)單、靈敏，適用于頭孢氨芐原料及膠囊有關(guān)物質(zhì)的檢測(cè)。

表1 頭孢氨芐及膠囊有關(guān)物質(zhì)測(cè)定結(jié)果—2015年版中國(guó)藥典方法Tab. 1 The determination results of the related substances of samples—ChP 2015

圖6 25℃/75%RH放置10d樣品HPLC色譜圖Fig. 6 HPLC chromatogram of sample placed under 25℃/75%RH for 10d

表2 頭孢氨芐及膠囊有關(guān)物質(zhì)測(cè)定結(jié)果—優(yōu)化后方法Tab. 2 The determination results of the related substances of samples—optimized method

表3 強(qiáng)制破壞性試驗(yàn)測(cè)定結(jié)果Tab. 3 The determination results of the destructive tests

表4 其他驗(yàn)證項(xiàng)目測(cè)定結(jié)果Tab. 4 The determination results of other verification items

圖7 25℃/75%RH放置10d樣品HPLC色譜圖Fig. 7 HPLC chromatogram of sample placed under 25℃/75%RH for 10d