吸水鏈霉菌FC-904發酵代謝產物29-O-去甲基雷帕霉素的分離和結構鑒定

楊國新 陳夏琴 余輝 黃洪祥 金東偉 程元榮 黃捷

(福建省微生物研究所，福建省新藥(微生物)篩選重點實驗室，福州 350007)

西羅莫司(也稱雷帕霉素)是一個多用途的藥物。吸水鏈霉菌FC904[1-3](Streptomyces hygroscopicusFC904)在發酵過程中除產生主產物西羅莫司外，同時還合成一些西羅莫司同系物。由于西羅莫司同系物結構與西羅莫司類似，在生產中不易分離，因此成為西羅莫司成品中雜質的主要來源。通過分離純化獲得這些西羅莫司同系物，確定它們的化學結構，一方面將有助于通過優化發酵工藝，降低它們在發酵液中的含量，減少后續分離純化的成本；另一方面，通過對這些有關物質的控制，也可降低西羅莫司成品中雜質的含量，以便進一步提高西羅莫司產品質量。在前期研究中，我們已經陸續分離并鑒定了一些西羅莫司同系物[4-7]。本文報道另一個西羅莫司同系物FIM-R85的分離純化和結構鑒定。

1 儀器設備與材料

1.1 實驗儀器

制備型液相色譜儀LC-20(日本島津公司)；高效液相色譜儀LC-2010CHT(日本島津公司)；核磁共振儀Bruker AM-500；Agilent 1100 series LC/MSD Trap；Bruker APEX Ⅲ7.0 TESLAFIMS高分辨質譜分析儀。

1.2 材料

西羅莫司發酵液粗提物(福建科瑞藥業有限公司提供)；200～300目硅膠(青島永海硅膠有限公司)；乙腈(色譜純)；甲醇(色譜純)；去離子水(本實驗室自制)；其他試劑均為國產分析純。

2 實驗方法與結果

2.1 HPLC分析方法

色譜柱：Kromasil C18(5μm, 4.6mm×250mm)；流動相：甲醇∶乙腈∶水(70:15:30,V/V/V)；流速：1mL/min；檢測波長：277nm；柱溫：40℃。

2.2 FIM-R85的富集

西羅莫司發酵粗提液中FIM-R85含量低， HPLC分析其只占1.1%，且出峰時間與西羅莫司接近(圖1)。為便于FIM-R85的分離純化，首先進行FIM-R85的富集。取西羅莫司的發酵液粗提物30g溶解于二氯甲烷，經硅膠(200～300目)柱層析(5cm×60cm)，二氯甲烷：無水乙醇(40:1,V/V)混合溶劑洗脫，分部收集，用高效液相跟蹤檢測。將分離得到的含FIM-R85的洗脫液減壓濃縮，得到黃色粉末。經HPLC檢測，該黃色粉末中FIM-R85占比提高至29.4%(圖2)。

2.3 FIM-R85的純化

圖1 粗提物的HPLC圖譜Fig. 1 HPLC analysis of crude extract

圖2 黃色粉末的HPLC圖譜Fig. 2 HPLC analysis of the yellow powder

稱取200mg上述含FIM-R85的黃色粉末，將其溶解于少量乙腈中，制備型液相色譜儀LC-20(日本島津公司)進行分離。分離柱(2cm×25cm)：ODS C18，10μm；流動相：乙腈:水(60:40,V/V)；檢測波長：277nm；柱溫：25℃；流速：6mL/min。分段收集，HPLC檢測。將分離得到的目標組分減壓濃縮去除乙腈和甲醇后用等體積的二氯甲烷分別萃取兩次，合并二氯甲烷層，減壓濃縮除去二氯甲烷獲得FIM-R85類白色粉末。HPLC分析表明，其純度為98.7%(圖3)。

2.4 結構解析

FIM-R85的紫外圖譜(圖4)中可以看出其紫外吸收特征峰與西羅莫司相同，溶解度也與西羅莫司類似；IR譜見圖5，其理化性質見表1。

由HRMS測定值顯示FIM-R85的分子式為C50H77NO13，分子量為899，比西羅莫司少14；FIM-R85的13C NMR譜(圖6)譜線絕大多數呈成對出現，且是一強一弱，從1H NMR譜(圖7)中可計算出強弱比例約為9:1，該現象表明：由于結構中酰胺鍵的旋轉受阻，導致該化合物在溶劑d6-DMSO中存在構象異構現象[8]。結合DEPT譜(圖8)，并從FIM-R85主要構象體的碳譜可以看出，該化合物分子所含有50個碳原子中，季碳3個，羰基碳5個，次甲基碳20個，亞甲基碳13個及甲基碳9個， 比西羅莫司少1個甲基碳。

圖3 FIM-R85的HPLC圖譜Fig. 3 HPLC analysis of FIM-R85

圖4 FIM-R85的UV圖譜Fig. 4 UV analysis of FIM-R85

表2列出了FIM-R85與西羅莫司主要構型的NMR光譜數據對比。與西羅莫司相比，在西羅莫司碳譜中存在的一個甲氧基的碳信號(δ56.89ppm)在FIM-R85的碳譜中消失；相對應的氫譜中西羅莫司具強吸收甲氧基的H信號(3.16ppm)，在FIM-R85的1H NMR譜中也消失。與該甲氧基相關的29位碳的位移也發生變化，由85.49ppm(西羅莫司)移到75.81ppm(FIM-R85)；而29位碳上的氫的位移則由3.93ppm(西羅莫司)移到4.32ppm(FIM-R85)。此外，在FIM-R85的氫譜中，在4.81ppm的位置，多了一個氫信號，經指認，該信號由29位碳相連的羥基氫引起，說明該化合物比西羅莫司少了一個CH2，與其HRMS測定值相吻合。結合其它譜圖和理化性質，數據表明FIM-R85是西羅莫司的類似物，其結構為29-O-去甲基雷帕霉素(圖9)。

圖5 FIM-R85的IR圖譜Fig. 5 IR analysis of FIM-R85

表1 FIM-R85的理化性質Tab. 1 Physico-chemical properties of FIM-R85

圖6 FIM-R85的13C NMR譜Fig. 6 13C NMR spectrum of FIM-R85

圖7 FIM-R85的1H NMR譜Fig. 7 1H NMR spectrum of FIM-R85

圖8 FIM-85的DEPT135譜Fig. 8 DEPT135 spectrum of FIM-R85

3 結論與討論

表2 FIM-R85與西羅莫司主要構型的NMR光譜數據對比a(d6-DMSO)Tab. 2 NMR spectroscopic data for major conformer of sirolimus and FIM-R85a (in d6-DMSO)

續表2

圖9 西羅莫司和FIM-R85的結構Fig. 9 The structures of sirolimus and FIM-R85

FIM-R85在西羅莫司發酵液粗提物中含量僅1.1%，采用以硅膠為固定相，二氯甲烷：無水乙醇(40:1)混合溶劑為洗脫劑的富集方法，獲得幾乎不含西羅莫司而目標物占29.4%的黃色粉末，目標物的比例得到很大的提高。應用制備型液相色譜儀進一步純化，得到HPLC純度為98.7%的FIM-R85純品。理化性質研究和NMR譜分析表明，FIM-R85結構與西羅莫司類似，分子量比西羅莫司少14，與29-O-去甲基雷帕霉素同質。西羅莫司產生菌在生物合成西羅莫司過程中，由聚酮合酶和非核糖體肽合成酶首先合成西羅莫司骨架—前西羅莫司(prorapamycin)，其C-29位為羥基。然后，由甲基轉移酶將甲硫氨酸的甲基轉移到前西羅莫司的C-29位的羥基上[9]。因此，西羅莫司發酵液中的29-O-去甲基雷帕霉素是西羅莫司產生菌合成的西羅莫司中間產物。Nishida等[10]曾報道在培養基中添加L-哌可酸，從西羅莫司產生菌游動放線菌(Actinoplanessp.)N902-109的發酵產物中分離得到該化合物；而胡方劍等[11]則通過對西羅莫司進行化學半合成的方法也獲得該化合物。