脂多糖缺失所致多黏菌素耐藥的鮑曼不動桿菌研究進(jìn)展

卞星晨 劉笑芬 張菁,* 陳代杰

(1 上海師范大學(xué) 生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，上海 200234；2 復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院 抗生素研究所，上海 200040；3 上海交通大學(xué)藥學(xué)院，上海 200240)

鮑曼不動桿菌是全球院內(nèi)感染的重要致病菌[1-2]，可引起醫(yī)院獲得性肺炎、血流感染、尿路感染和傷口感染等各種感染性疾病[3]。隨著抗生素的大量和不恰當(dāng)?shù)氖褂茫U曼不動桿菌對抗生素耐藥的情況日漸突出，在一些國家，對常用藥物如碳青霉烯的耐藥率已高達(dá)70%[4]。因缺乏新的有效的治療藥物，臨床上開始使用“古老的”抗生素多黏菌素B和黏菌素(多黏菌素E)治療廣泛耐藥鮑曼不動桿菌所致的各種感染[5]。然而，多黏菌素使用出現(xiàn)的耐藥性問題在歐洲、亞洲、美洲、非洲多個國家均有報道[6-9]。已報道的鮑曼不動桿菌耐藥機制主要有由脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)缺失以及LPS修飾所致[10]。本文將簡要綜述脂多糖缺失所致多黏菌素耐藥鮑曼不動桿菌的有關(guān)研究進(jìn)展。

多黏菌素有A、B、C、D和E共5種。目前只有多黏菌素B和E被批準(zhǔn)上市。多黏菌素為帶正電的陽離子、含三肽側(cè)鏈的環(huán)狀七肽，環(huán)肽與側(cè)鏈通過α氨基相連接[11](圖1為多黏菌素B和E的結(jié)構(gòu)[12-13])。

多黏菌素對革蘭陰性菌具有強大的抗菌活性，其主要作用于革蘭陰性菌的細(xì)胞膜而發(fā)揮抗菌作用。革蘭陰性菌的外膜由脂多糖LPS層和磷脂層組成，帶正電的多黏菌素與LPS層中脂質(zhì)A上帶負(fù)電的磷酸基團(tuán)發(fā)生靜電吸引，與磷酸酯鍵相互結(jié)合，置換了膜上具有橋連穩(wěn)定作用的二價陽離子，如鈣離子和鎂離子，然后多黏菌素疏水基團(tuán)N端脂肪酸部分插入其中，細(xì)胞膜穩(wěn)定性遭破壞，細(xì)胞內(nèi)成分丟失，細(xì)菌死亡[14-15]。

革蘭陰性菌的外膜是非對稱雙分子層；LPS為外層，包含成分有脂質(zhì)A、核心多糖和O-特異側(cè)鏈；磷脂層為內(nèi)層，其間鑲嵌有多種脂蛋白、孔蛋白、外膜蛋白[16]。脂質(zhì)A以β-1',6相連的氨基兩個葡萄糖為骨架，2,3,2',3'位置被(R)3-羥十四酸殘基?；?，與非還原糖連接的脂肪酸又在羥基上進(jìn)一步?；?，產(chǎn)生?；人岬慕Y(jié)構(gòu)。另外，二糖結(jié)構(gòu)末端1和4'位被磷酸化，帶負(fù)電(圖2)[17]。

1 LPS缺失鮑曼不動桿菌對多黏菌素的耐藥機制

鮑曼不動桿菌脂多糖的結(jié)構(gòu)修飾，是報道較多的一種對多黏菌素的耐藥機制。該耐藥機制主要是由于pmrB基因發(fā)生點突變，pmrAB基因表達(dá)水平上調(diào)，磷酸乙醇胺(PEtN)轉(zhuǎn)移相關(guān)基因pmrC高表達(dá)。PEtN對脂質(zhì)A的N-乙酰葡糖胺的4'位進(jìn)行修飾，使外膜負(fù)電荷降低，與黏菌素親和力降低而產(chǎn)生耐藥[17-19]。另外，脂質(zhì)A的糖苷化(己糖胺)也是造成細(xì)菌對多黏菌素產(chǎn)生耐藥性的重要機制之一，可使多黏菌素對其MIC達(dá)到1.5～48μg/mL[18]。在多黏菌素耐藥鮑曼不動桿菌耐藥菌中還有較多的庚?；闹|(zhì)A。這些以脂質(zhì)A修飾造成的耐藥機制，與其他一些腸桿菌科細(xì)菌對多黏菌素產(chǎn)生耐藥的機制相同。

圖1 多黏菌素B和多黏菌素E的結(jié)構(gòu)Fig. 1 The structure of polymyxin B and colistin

脂多糖完全缺失的鮑曼不動桿菌，首先由Moffatt等[11]在含有高濃度黏菌素(10μg/mL)的固體培養(yǎng)基中被發(fā)現(xiàn)，經(jīng)測定其細(xì)胞膜表面的脂多糖缺失，且脂質(zhì)A的合成基因lpxACD發(fā)生核苷酸突變或缺失。通過質(zhì)粒pAL840導(dǎo)入完整的lpxA基因，可使其對黏菌素敏感性恢復(fù)。此耐藥機制在鮑曼不動桿菌ATCC19606以及臨床菌株中均有發(fā)現(xiàn)。但脂質(zhì)A僅是黏菌素作用的初級靶點，因而即使缺失脂質(zhì)A，藥物仍然具有一定的抗菌活性。

LPS對于許多革蘭陰性菌的生長至關(guān)重要，多數(shù)細(xì)菌失去LPS后無法生存[20]，而鮑曼不動桿菌在失去LPS后仍能生存并獲得對多黏菌素的耐藥性。失去LPS的鮑曼不動桿菌在適應(yīng)性、表達(dá)譜、與宿主相互作用等很多方面都發(fā)生了變化。

圖2 不動桿菌脂質(zhì)A結(jié)構(gòu)Fig. 2 The structure of lipid A of Acinetobacter baumannii

為進(jìn)一步研究LPS缺失引起的基因表達(dá)的改變，Henry等[16]使用高通量RNA測序比較耐藥株19606R和敏感株ATCC19606的轉(zhuǎn)錄組差異。結(jié)果顯示，耐藥菌中有229個基因表達(dá)改變，其中123個表達(dá)上調(diào)，106個表達(dá)下調(diào)。在123個上調(diào)基因中，超過9%的基因與編碼外膜蛋白與外膜合成相關(guān)蛋白有關(guān)，包括Mla逆行磷脂轉(zhuǎn)運系統(tǒng)的相關(guān)基因mlaBCD表達(dá)增加5.3～7.5倍，Lol脂質(zhì)轉(zhuǎn)運系統(tǒng)中的編號基因lolA、lolB、lolD和lolE在耐藥株中表達(dá)增加4.9～27.9倍，PNAG(polyβ-1,6-N-acetylglucosamin，聚β-1,6-N-乙酰葡萄糖胺)的合成與轉(zhuǎn)運相關(guān)的pgaABCD在耐藥株中表達(dá)增加14.9～48.5倍。該結(jié)果表明耐藥株彌補LPS的缺失主要通過3個轉(zhuǎn)運系統(tǒng)進(jìn)行調(diào)控，即Mla逆行磷脂轉(zhuǎn)運系統(tǒng)，Lol脂質(zhì)轉(zhuǎn)運系統(tǒng)，PNAG生物合成和轉(zhuǎn)運系統(tǒng)。此外，耐藥株的外排泵系統(tǒng)比敏感株更為活躍，可以排出細(xì)胞內(nèi)毒性物質(zhì)。這一系列變化使缺乏LPS的外膜仍能維持其功能，以保證細(xì)菌存活與生長。

一個有趣的現(xiàn)象是，這種LPS缺失的革蘭陰性菌對阿奇霉素、利福平、萬古霉素等抗生素敏感性提高，分析推測的原因可能是：原存在于外膜上的LPS分子之間有很強的橫向相互作用，因而對于胞外物質(zhì)具有較強的選擇性透過作用。而當(dāng)LPS缺失后，這種橫向相互作用下降，致使選擇透過作用下降。這一改變提示這些抗生素或許可以成為針對LPS缺失耐藥株的潛在的治療選擇[11,21]。

2 LPS缺失鮑曼不動桿菌的表面結(jié)構(gòu)變化

耐藥鮑曼不動桿菌在高濃度多黏菌素(32mg/L)以及無多黏菌素時都能保持完整，有明顯的細(xì)胞聚集，也會聚集成鏈或集落。電鏡觀察發(fā)現(xiàn)即使缺失了LPS，耐藥株仍有外膜存在[11]。另外，LPS缺失鮑曼不動桿菌的形態(tài)也會發(fā)生變化：在對數(shù)生長期，敏感菌呈棒狀，耐藥菌株偏圓形；平臺穩(wěn)定期敏感菌在無抗生素條件下發(fā)生細(xì)胞延長，呈細(xì)長狀，耐藥菌株也略微延長，呈短棒狀[22-23]。

在進(jìn)行研究中檢測細(xì)菌表面電荷量十分必要，因為鮑曼不動桿菌對多肽類抗生素如多黏菌素的敏感性與細(xì)菌表面電荷有著密切的關(guān)系[14]。細(xì)菌表面電荷量可用Zeta電位表示。

Soon等[14]分別在多黏菌素B或黏菌素(1、4和8mg/L)存在下對細(xì)菌電位進(jìn)行測定。結(jié)果顯示，在8mg/L多黏菌素B或黏菌素存在下鮑曼不動桿菌敏感菌株與耐藥菌株的Zeta電位均顯著上升，且數(shù)值高于1與4mg/L條件下的上升值。表明多黏菌素的存在對細(xì)菌表面負(fù)電荷有中和作用，且藥物濃度越高，中和作用越強，Zeta電位也就越高。在耐藥菌株中，外膜負(fù)電荷均比敏感菌株有所減少，對多黏菌素的中和作用減弱。盡管中和耐藥菌和敏感菌負(fù)電荷所需多黏菌素差別不大，但耐藥株比敏感株的耐藥性高100倍以上。

同時Soon等[23]運用原子力顯微技術(shù)研究敏感菌株與LPS缺失耐藥菌株表面性能的差異，多黏菌素暴露量與生長階段對表面性能產(chǎn)生不同的影響。結(jié)果表明，在每個生長階段，敏感菌株比耐藥菌株表面更加堅硬，機械強度更大，可能是敏感菌中的二價陽離子的橋連作用以及脂質(zhì)A鏈飽和烴之間的橫向作用形成了堅硬的外膜[24]。熒光探針實驗證明基因回補株可以產(chǎn)LPS，但表面機械強度小于敏感菌株，可能暗示回補菌株的LPS含量少于敏感菌株。對于敏感菌株，用低濃度多黏菌素(1mg/L)處理使其機械強度降低，因多黏菌素與細(xì)菌特異性結(jié)合使外膜變得不穩(wěn)定；而高濃度多黏菌素(32mg/L)處理使其機械強度增加，因多黏菌素與LPS特異性結(jié)合位點已飽和，非特異性結(jié)合被放大，多黏菌素在外膜上積聚引起機械強度增加。對于耐藥菌株，多黏菌素均以非特異性方式與LPS結(jié)合，因此高低濃度均能增加其機械強度[23]。

另外，在生長速率方面，多黏菌素耐藥鮑曼不動桿菌與敏感菌在MH瓊脂(MHA)平板上的生長速率相近，但耐藥株的菌落形態(tài)變小[11]。Mu等[25]的研究結(jié)果顯示，LPS缺失耐藥株的生長速度減慢。

3 LPS缺失的鮑曼不動桿菌對宿主的影響

3.1 對細(xì)胞毒力的影響

LPS中的脂質(zhì)A是革蘭陰性菌致病物質(zhì)內(nèi)毒素的物質(zhì)基礎(chǔ)，因此LPS的存在與否影響細(xì)胞毒力[26]。

分別用敏感菌株和LPS缺失耐藥突變菌株感染小鼠模型，根據(jù)小鼠存活率及半數(shù)致死量LD50等指標(biāo)判斷細(xì)菌毒力。在ATCC19606的菌落數(shù)為1×107、4×107、12×107以及40×107CFU/mL時，小鼠死亡率分別為0、0、80%和100%。在耐藥菌株菌落數(shù)為3×107，12×107，25×107，40×107以及80×107CFU/mL時，小鼠死亡率分別為0、0、0、20%和60%。半數(shù)致死量分別為10×107和63.5×107CFU/mL。由此可見，LPS缺失使細(xì)菌毒力大大降低[27-28]。

3.2 對固有免疫系統(tǒng)的影響

當(dāng)細(xì)菌入侵宿主，宿主會首先啟動固有免疫系統(tǒng)抵御細(xì)菌的入侵。單核巨噬細(xì)胞表面的CD14分子和Toll樣受體識別細(xì)菌，與細(xì)菌表面的LPS結(jié)合，激活NF-κB信號通路，能夠改變基因的表達(dá)，通路激活后可引起機體發(fā)生炎癥反應(yīng)[29]，比如巨噬細(xì)胞分泌腫瘤壞死因子(TNF)，主要是TNF-α，發(fā)揮抗感染的作用。

MyD88是Toll樣受體信號通路中重要的轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白，TLR2與TLR4通過轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白MyD88與Mal作用傳遞信號。研究者分別選取了TLR2缺失、TLR4缺失及MyD88/Mal缺失小鼠的巨噬細(xì)胞，用加熱滅活的LPS缺失耐藥菌株19606R與標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC19606對其進(jìn)行刺激，檢測TNF-α產(chǎn)生的量，研究固有免疫在敏感和耐藥菌株中如何產(chǎn)生TNF-α。研究發(fā)現(xiàn)，缺乏MyD88/Mal時未見明顯的TNF-α產(chǎn)生，證明與MyD88/Mal的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)有關(guān)。在TLR-4缺失的巨噬細(xì)胞中，LPS缺失耐藥株能刺激更多的TNF-α分泌，在TLR2缺失細(xì)胞，結(jié)果相反。表明LPS缺失鮑曼不動桿菌在一定程度上通過TLR-2信號通路刺激TNF-α的分泌，但分泌水平低于敏感菌，故不會導(dǎo)致由TNF-α過度分泌導(dǎo)致的感染性休克[30]。

比較LPS缺失耐藥菌株與敏感菌株引起的固有免疫的差異發(fā)現(xiàn)，LPS缺失使得NF-κB信號通路的激活減弱，TNF-α的分泌也有所減少，因此宿主對細(xì)菌的固有免疫應(yīng)答減少。

LL-37是存在于人血清中的陽離子抗菌肽，由中性粒細(xì)胞和上皮細(xì)胞產(chǎn)生，可直接殺滅大量病原菌菌落，在固有免疫的調(diào)控中起重要作用。LL-37與黏菌素的抗菌作用機制有相似之處，最初都是因為靜電吸引[31]。與多黏菌素不同的是，LL-37對LPS缺失耐藥株有殺菌作用，且耐藥株比敏感株對LL-37的敏感度更高，說明其殺菌作用不依賴于LPS，可能與膜滲透性下降有關(guān)[32]。有研究證實LL-37對許多革蘭陰性菌、病毒和真菌也有殺菌作用，也證明其不依賴于LPS發(fā)揮作用[31]。

另外，存在于黏膜分泌物中的溶菌酶也對細(xì)菌有殺滅作用，其作用靶部位是肽聚糖，LPS缺失后，細(xì)菌內(nèi)壁層的肽聚糖暴露，溶菌酶更易接近靶部位，水解肽聚糖，故LPS缺失耐藥菌株對溶菌酶的敏感性更高，使其更易被清除[33]。

4 小結(jié)

多黏菌素耐藥性的日趨嚴(yán)重將使得臨床上治療鮑曼不動桿菌感染面臨無藥可用的困境。LPS缺失所致耐藥可引起細(xì)菌適應(yīng)性下降，外膜合成相關(guān)基因表達(dá)增加，對其他抗生素敏感性提高，機械強度降低，細(xì)菌毒力下降，固有免疫因子水平變化等。

以脂多糖缺失所致多黏菌素耐藥的鮑曼不動桿菌一系列性質(zhì)的改變?yōu)槌霭l(fā)點，進(jìn)一步深入研究鮑曼不動桿菌對多黏菌素耐藥機制，尋找新的有效的抗菌作用靶點或者抗菌物質(zhì)，或許會獲得意想不到的結(jié)果。