苗藥頭花蓼對感染幽門螺桿菌胃炎細胞TLRs信號通路的影響*＊

江明禮，莫 非＊，渠 巍，孫朝琴，羅昭遜，張 姝，吳銀杰

(1.貴州醫科大學，貴州貴陽 550004;2.貴陽市兒童醫院檢驗科，貴州貴陽 550003)

幽門螺桿菌(Helicobacter pylori，H.pylori)是人類最常見的慢性感染致病菌之一，多在胃黏膜上定植，可侵入宿主防御系統，通過產生毒素及誘導炎癥反應等對人體造成傷害［1－2］。Toll樣受體(Tolllike receptors，TLRs)是研究最為廣泛的模式識別受體之一，在天然免疫防御中起著重要作用［3－4］。前期體內實驗表明，H.pylori相關性胃炎模型大鼠經苗藥頭花蓼治療后，胃部炎癥減輕，胃黏膜TLR4蛋白表達下調［5］，提示該藥具有抗炎抑菌，調節固有性免疫的作用，但其抗H.pylori胃炎的作用機制仍尚未明了。為進一步明確體內頭花蓼與TLRs信號通路的相關性，本實驗采用人永生化胃黏膜上皮細胞(GES-1)與H.pylori共培養建立感染H.pylori的胃炎細胞模型并觀察其形態變化，采用實時熒光定量PCR及Western blot法觀察頭花蓼對 TLR2、TLR4、TLR5、TLR9 及下游因子 MyD88、TRAF6 mRNA和蛋白表達的影響，探討頭花蓼對TLRs信號通路的影響，為頭花蓼抗H.pylori治療提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 細胞、藥物及試劑

人永生化胃黏膜上皮細胞(GES-1，上海腫瘤研究所)，H.pyloriATCC 700392(中國疾病控制中心傳染病所張建中教授惠贈);苗藥頭花蓼浸膏(粉)，生藥量為9.17 g/g，浙江眾益制藥有限公司提供，批號14196;Trizol購自Invitrogen公司，熒光定量PCR試劑盒、RNA逆轉錄試劑盒購自Takara公司，組織蛋白提取試劑盒、BCA蛋白定量試劑盒、rabbit-anti-TLR2、rabbit-anti-TLR4、rabbit-anti-TLR9、rabbit-anti-TRAF6、rabbit-anti-GAPDH 均購自萬類生物有限公司，abbit-anti-MyD88購自CST公司，rabbit-anti-TLR5購自Bioworld公司，HRP標記抗羊抗兔IgG抗體購于杭州聯科生物公司。熒光定量PCR儀(德國ROCHE)，Western Blot電泳儀及轉膜系統(美國Bio-Rad)。

1.2 方法

1.2.1H.pylori的培養 按照文獻［6］將凍存的H.pyloriATCC 700392室溫溶解后，轉移至哥倫比亞血平皿內，置于三氣培養箱(85%N2、10%CO2、5%O2，溫度37℃、相對濕度95%)穩定培養3代備用。

1.2.2 GES-1細胞的培養 從液氮中取出GES-1細胞于37℃水浴箱解凍后，轉移至含有9 mL DMEM培養基的10 mL離心管中，吹打混勻，1 000 r/min離心5 min，棄上清后加入2 mL含10%胎牛血清的高糖DMEM培養基重懸;將重懸的細胞移入細胞培養瓶中，加入3 mL上述培養基中，在5%CO2、溫度37℃、相對濕度95%培養箱中穩定培養3代備用。

1.2.3 細胞模型的復制及分組 按照課題組前期研究方法［7］將GES-1細胞隨機分為空白組、模型組及藥物組，模型組和藥物組H.pylori細菌與GES-1細胞以100∶1的比例共培養12 h建立感染H.pylori的胃炎細胞模型。無血清培養基饑餓培養4 h后，藥物組給予頭花蓼干預48 h，空白組、模型組給予等量培養基，各組細胞均于5%CO2、溫度37℃、相對濕度90%培養箱中培養48 h。

1.2.4 顯微鏡檢查 模型復制成功、給予相應處理48 h后，將各組細胞置于倒置顯微鏡下觀察并采圖。同時制作細胞爬片并采用特制固定液(取自重慶醫科大學生命科學院電鏡室)固定細胞，置于4℃冰箱內固定2 d，送至重慶醫科大學生命科學院電鏡室進行掃描及投射電子顯微鏡觀察。

1.2.5 TLRs及相關因子mRNA表達檢測 在給予相應處理48 h后，Omega試劑盒提取各組細胞的總RNA，用酶標儀對提取的總RNA進行測定。按照TaKaRa逆轉錄試劑盒將RNA逆轉錄為cDNA，－20℃保存備用。以β-actin作為內參基因，采用primer 5設計PTEN、AKT擴增引物(見表1)。20μL反應體系包括2.0μL DNA模版，0.8μL上、下游引物，10 μL SYBR Premix ExTaqTMII，6.4 μL滅菌ddH2O。反應條件為95℃ 30 s，95℃ 5 s，56 ℃ 20 s，40 個循環。各組數據采用 2－ΔΔCT法對目標基因進行分析。

表1 PCR擴增引物基因序列Tab.1 The sequences of the primers for real-time PCR

1.2.6 TLRs及相關因子蛋白表達檢測 在給予各組細胞相應處理48 h后，提取蛋白，配置10%SDS-PAGE凝膠，行電泳分離(上樣量為20μg/孔)，將電泳物轉移至0.45μm PVDF膜，5%脫脂奶粉室溫搖封閉2 h，洗膜后加入抗 TLR2、TLR4、TLR9、TRAF6 抗體(稀釋比例 1∶500) 、TLR5、MyD88抗體(稀釋比例1∶1 000)4℃孵育過夜。第2天洗膜后加入熒光二抗(稀釋比例1∶10 000)，室溫孵育1 h后加入顯色液。采用自動曝光儀曝光并采圖，后用Image J灰度掃描軟件進行灰度掃描。

1.3 統計學處理

所有實驗均重復3次及以上。采用SPSS17.0統計軟件進行分析，計量資料用均數±標準差(±s)表示，兩兩比較用t檢驗，多組比較采用單因素方差分析，方差齊采用LSD檢驗，方差不齊采用Dunnett-t進行方差分析，P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 感染H.pylori的GES-1胃炎細胞形態

2.1.1 光學顯微鏡 倒置顯微鏡下，見空白組背底干凈，細胞外觀飽滿呈梭形，表面光滑，附著顆粒物質較少;模型組多數細胞瘦長，表面不光滑，顆粒物質明顯較空白組增多;藥物作用后，細胞狀態有顯著改善，背底清晰，細胞邊緣較模型組整齊，顆粒物質明顯變少，見圖1。

2.1.2 掃描電鏡 掃描電鏡下對空白組、模型組及藥物組GES-1細胞進行觀察，見空白組細胞形態豐滿，表面光滑，外泌體較少;模型組細胞多瘦長，可見點狀或片狀物質黏附于表面;藥物干預后，藥物組細胞較模型組外泌體減少，顆粒物質較少，邊緣趨于整齊。見圖2。

圖1 光學顯微鏡下各組GES-1細胞形態(200×)Fig.1 Morphology of GES-1 gastritis cells in each group under optical microscope

圖2 掃描電鏡下各組GES-1細胞形態(600×)Fig.2 Morphology of GES-1 gastritis cells in each group under scanning electron microscope

2.1.3 透射電鏡 透射電鏡下可見空白組細胞膜表面絨毛層均勻整齊，整體形態飽滿，細胞器形態正常;而模型組細胞膜表面絨毛層疏松，細胞器皺縮，自噬小體減少;藥物組細胞較模型組背底清晰整潔，細胞形態大體完整，細胞絨毛緊貼細胞膜，細胞器趨于正常，核膜形態較好，見圖3。

圖3 透射電鏡下各組GES-1細胞形態(5 000×)Fig.3 Morphology of GES-1 gastritis cells in each group under transmission electron microscope

2.2 頭花蓼對感染H.pylori的GES-1細胞TLR2、TLR4、TLR5、TLR9 及 MyD88、TRAF6 mRNA 水平的影響

qRT-PCR結果顯示，H.pylori感染GES-1細胞后，TLR2、TLR4、TLR5、TLR9 及MyD88、TRAF6 mRNA水平較空白組上調(P＜0.05);與模型組相比，頭花蓼干預后TLR2、TLR4、TLR5、TLR9 及MyD88、TRAF6 mRNA水平下調 (P＜0.05)，提示頭花蓼可下調TLRs信號通路mRNA表達水平改善幽門螺桿菌胃炎炎癥反應。見表2。

表2 頭花蓼對TLR2、TLR4、TLR5、TLR9及MyD88、TRAF6 mRNA水平的影響(±s)Tab.2 Effects of Polygonum capitatum on TLR2，TLR4，TLR5，TLR9，MyD88 and TRAF6 mRNA levels

表2 頭花蓼對TLR2、TLR4、TLR5、TLR9及MyD88、TRAF6 mRNA水平的影響(±s)Tab.2 Effects of Polygonum capitatum on TLR2，TLR4，TLR5，TLR9，MyD88 and TRAF6 mRNA levels

(1)與空白組比較，P＜0.05;(2)與模型組比較，P＜0.05

基因 mRNA表達水平空白組 模型組 頭花蓼組TLR2 1.064±0.059 7.329±0.204(1)5.075±0.034(2)TLR4 1.042±0.044 1.888±0.009(1)1.141±0.049(2)TLR5 0.940±0.052 1.622±0.028(1)1.159±0.047(2)TLR9 0.960±0.036 4.221±0.355(1)1.198±0.075(2)MyD88 1.037±0.076 3.352±0.144(1)1.823±0.135(2)TRAF6 0.995±0.028 3.443±0.020(1)1.633±0.108(2)

2.3 頭花蓼對感染H.pylori的GES-1細胞TLR2、TLR4、TLR5、TLR9 及 MyD88、TRAF6 蛋白水平的影響

Western blot結果顯示，模型復制成功后，模型組 TLR2、TLR4、TLR5、TLR9 及 MyD88、TRAF6 較空白組上調(P＜0.05);與模型組相比，頭花蓼組TLR2、TLR4、TLR5、TLR9 及 MyD88、TRAF6 下調(P＜0.05)。提示頭花蓼下調TLRs蛋白表達量，抑制下游炎癥因子的激活，從而減輕炎癥反應。見圖4。

3 討論

H.pylori是目前公認的能引起相關性胃炎、消化性潰瘍、胃癌等的主要病因［8－9］，作為人類消化系統最常見的致病菌和模式病原菌之一，當它進入機體后可引起炎癥和免疫反應失衡，人胃黏膜固有免疫及獲得性免疫會發生異常。Toll樣受體是目前研究最為廣泛的模式識別受體，可通過識別并結合微生物的病原相關分子模式，進而啟動自身固有免疫系統來對外來抗原進行直接清除。有研究表明，TLRs與H.pylori致病密切相關［10－11］，胃黏膜上皮細胞是H.pylori與宿主之間的第一接觸點，而TLRs作為細胞中重要的病原模式識別受體通過識別微生物及其相關產物啟動機體內免疫系統，在H.pylori胃炎致病過程中作用中發揮重要作用。

圖4 頭花蓼對感染H.pylori的GES-1細胞TLR2、TLR4、TLR5、TLR9 及 MyD88、TRAF6蛋白水平的影響Fig.4 Effects of Polygonum capitatum on the protein levels of TLR2，TLR4，TLR5，TLR9，MyD88 and TRAF6 in GES-1 cells infected with H.pylori

苗藥頭花蓼是貴州傳統中草藥，具有清熱解毒抗菌的功效［12］。課題前期研究發現其對H.pylori相關性胃炎具有良好的抗炎效果;且動物實驗發現H.pylori感染后大鼠胃黏膜TLR4 mRNA表達升高，而苗藥頭花蓼可下調TLR4 mRNA的表達水平，推測頭花蓼可能通過調控TLRs信號通路改善H.pylori胃炎。故本實驗通過構建感染H.pylori胃炎細胞模型觀察頭花蓼改善H.pylori胃炎的機制。

實驗結果顯示，經H.pylori感染后GES-1胃炎細胞在光學顯微鏡下背底模糊，整體較瘦長，表面粗糙，顆粒物質明顯增多;掃描電子顯微鏡觀察，可見GES-1胃炎細胞形態各異，外泌體增多，有大量顆粒物質附著，推測H.pylori黏附定植于GES-1細胞表面，菌體及相關毒性物引起細胞產生病理改變;進一步使用透射電鏡進行超微結構觀察發現，細胞膜表面絨毛層疏松，細胞器皺縮，偽足腫脹，自噬小體減少，提示H.pylori的感染會引起細胞整體及微觀形態結構的相應改變。

眾多研究表明，中藥材可通過抑制Toll樣受體的表達，進而控制病情的發展。李思漢等［13］通過對大鼠慢性萎縮性胃炎的研究，發現健脾清化中藥復方可有效阻斷TLR4信號通路的持續活化，并可使造模成功的大鼠胃黏膜恢復正常。本研究結果顯示，H.pylori感染 GES-1后，細胞 TLR2、TLR4、TLR5、TLR9和下游因子 MyD88、TRAF6 mRNA 及蛋白水平均相應升高，此與王小娟［14］、Schmausser B［15］、盧震亞［16］的研究結果相符。該結果證實，經H.pylori感染后，菌體及相關病原模式分子，如脂多糖、鞭毛、DNA片段等刺激相應模式識別受體，啟動細胞固有免疫系統，激活下游炎癥通路，產生炎癥反應。在使用頭花蓼治療后，TLR2、TLR4、TLR5、TLR9和下游因子 MyD88、TRAF6 mRNA 及蛋白水平明顯降低，且對TLR5的作用最為顯著。推測頭花蓼可能是通過抑制TLRs基因轉錄，抑制TLRs蛋白表達，從而抑制下游炎癥因子的激活和釋放，從而達到改善幽門螺桿菌胃炎的目的。

綜上，經H.pylori感染后，GES-1胃炎細胞中TLRs通路因子表達明顯升高，說明H.pylori可激活TLRs通路并引發炎癥效應。而頭花蓼作用后，TLRs通路及其相關因子表達有所下調，其中TLR5的作用較為顯著。故本實驗證實了苗藥頭花蓼可通過干預TLRs通路來調節H.pylori胃炎的發生發展，為臨床治療胃炎提供新的思路和理論依據。