ECRG4對人喉鱗癌細胞Hep-2侵襲轉移的影響及其分子機制*＊

賈建平，孫曉慧

(中國人民解放軍北部戰區空軍醫院，遼寧沈陽 110042)

喉鱗狀細胞癌源于喉部黏膜上皮，是第二常見的頭頸部鱗狀細胞癌［1］。目前，世界喉鱗狀細胞癌發病率逐漸增加，尤其在年輕人中呈上升趨勢［2］。喉部的特殊解剖結構使得喉鱗狀細胞癌極易發生局部侵襲和頸淋巴結轉移［3］，導致患者疾病復發和預后不良。食管癌相關基因4((ECRG4)是一種腫瘤候選抑制基因，在食管鱗癌、乳腺癌、結腸直腸癌和神經膠質細胞瘤中表達下調［4－6］，有報道其并可抑制頭頸鱗癌［7］、肝癌［8］的增殖、遷移和侵襲，還可抑制喉鱗癌細胞的增殖、促進細胞凋亡［9］，但其機制尚不清楚。上皮間質轉化(EMT)是上皮細胞從有極性不能移動的上皮細胞轉化為間質細胞過程，細胞發生EMT后上皮標志物E-cadherin表達下調、EMT間質標志物 N-cadherin、Vinmentin表達上調，遷移和侵襲能力增加。本實驗通過體外實驗探究ECRG4對Hep-2細胞EMT發生、遷移和侵襲的影響及分子機制，以期闡明喉癌侵襲和轉移的分子機制，提高喉癌的生存期和治愈率。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

胎牛血清購自以色列Biological Industries(BI)公司，DMEM培養基購自美國Gibco，胰酶購自江蘇碧云天生物技術研究所，轉染試劑Lipofectamine2000購自美國Invitrogen，TRIpure總 RNA提取試劑、Super M-MLV反轉錄酶均購自北京百泰克生物技術有限公司，SYBR Green購自北京索萊寶科技有限公司，結晶紫購自美國Amresco公司，Matrigel基質膠購自美國BD公司，BCA蛋白濃度測定試劑盒、ECRG4抗體、E-cadherin抗體、N-cadherin D1抗體、Vinmentin 抗體、Snail抗體、NF-κB p65 抗體均購自沈陽萬類生物科技有限公司。

1.2 細胞培養及轉染

人喉癌細胞Hep-2及pcDNA3.1載體均購自萬類生物科技有限公司。Hep-2細胞用含10%胎牛血清的DMEM培養基于37℃，5%CO2的培養箱內培養。將全長野生型ECRG4 CDS序列克隆入pcDNA3.1載體，構建ECRG4過表達載體(ECRG4-pcDNA3.1)，基因測序證明載體構建成功。根據Lipofectamine2000操作說明轉染ECRG4-pcDNA3.1質粒(ECRG4組)或空載體質粒(Vector組)，并設立未轉染Hep-2細胞組(Control組)。

1.3 實時熒光定量PCR檢測ECRG4的表達

利用總RNA提取試劑及cDNA合成試劑提取細胞總RNA并反轉錄至cDNA，放入ExicyclerTM 96熒光定量儀(BIONEER，韓國)進行熒光定量反應，采用2－ΔΔCT法對ECRG4 mRNA進行定量分析。ECRG4基因引物序列如下，ECRG4-F為5'-TGACATCACCTATTGGCTTA-3'，ECRG4-R 為 5'-GAAT CGCTATTTGCTTCTTG-3';內參基因 β-actin-F為5'-CTTAGTTGCGTTACACCCTTTCTTG-3'，β-actin-R為5'-CTGTCACCTTCACCGTTCCAGTTT-3。

1.4 劃痕實驗檢測細胞遷移能力

實驗前將培養基換為無血清培養基并加入1 mg/L的絲裂霉素C處理1 h，利用200μL pipette tip造成細胞劃痕，用無血清培養基清洗細胞表面1次，顯微鏡下觀察并按組拍照，記錄照片中細胞的位置，記為0 h，并換用無血清培養基于37℃、5%CO2培養箱中分別培養24 h進行再次拍照記錄，記為24 h，計算細胞遷移距離。

1.5 Transwell實驗檢測細胞遷移能力

胰酶消化收集細胞，分別將200μL細胞懸液加入Transwell上室(細胞量5×103/孔)，下室加入含20% 胎牛血清的培養液800μL，置于37℃、5%CO2、飽和濕度條件下培養24 h。甲醛固定，結晶紫染色，在倒置顯微鏡下計數遷移至微孔膜下層5個視野的細胞，取均數。

1.6 Transwell實驗檢測細胞侵襲能力

胰酶消化收集細胞，分別將200μL細胞懸液加入預先鋪有Matrigel基質膠的Transwell上室(細胞量2×104/孔)，下室加入含20% 胎牛血清的培養液800μL。置于37℃、5%CO2、飽和濕度條件下培養24 h，甲醛固定，結晶紫染色，在倒置顯微鏡下計數侵襲至微孔膜下層5個視野的細胞，取均數。

1.7 Western Blot檢測 ECRG4、Snail、E-cadherin、N-cadherin、Vinmentin及胞漿和胞核蛋白中NF-κB p65蛋白表達

RIPA裂解法提取樣本總蛋白及細胞漿和細胞核蛋白，采用 BCA法對蛋白進行定量，取20～40μg蛋白上樣，行SDS-PAGE并轉印至PVDF膜，經5%(M/V)脫脂奶粉封閉1 h后，加入適當稀釋的 ECRG4、Snail、E-cadherin、N-cadherin、Vinmentin、NF-κB p65抗體4℃過夜孵育，TBST緩沖液清洗PVDF膜，放入二抗羊抗小鼠IgG-HRP(1∶5 000)工作液中37℃孵育45 min，ECL底物發光，采用凝膠圖象處理系統(Gel-Pro-Analyzer軟件)分析目標條帶光密度值。

1.8 統計學方法

采用SPSS18.0統計軟件進行數據分析，實驗數據以均數±標準差(±s)表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗，P＜0.05表示差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 ECRG4表達

ECRG4組Hep-2細胞中ECRG4 mRNA的表達較Control組及Vector組顯著上調(P＜0.01)，見圖 1A;ECRG4蛋白在 Control組及 Vector組Hep-2細胞中呈現低表達，ECRG4組Hep-2細胞中ECRG4蛋白表達較Control組及Vector組顯著上調(P＜0.01)，與mRNA表達趨勢基本一致，見圖1B。

圖1 各組Hep-2細胞中ECRG4基因和蛋白表達水平Fig.1 Expression of ECRG4 gene and protein in Hep-2 cells

2.2 ECRG4對Hep-2細胞遷移能力影響

細胞劃痕檢測Hep-2細胞遷移能力，結果顯示ECRG4組細胞遷移率較Control組及Vector組顯著下降(P＜0.01)，見圖2A;Tanswell實驗檢測Hep-2細胞遷移，結果顯示ECRG4組與Control組及Vector組相比細胞遷移數顯著減少(P＜0.01)，見圖2B。

2.3 ECRG4對Hep-2細胞侵襲能力影響

Tanswell實驗檢測Hep-2細胞侵襲能力，結果顯示ECRG4組Hep-2細胞侵襲數較Control組及Vector組顯著減少(P＜0.01)，見圖3。

2.4 ECRG4對Hep-2細胞NF-κB信號通路的活化的影響

為了觀察ECRG4對NF-κB信號通路的影響，通過Western Blot檢測各組Hep-2細胞細胞核與胞漿中NF-κB p65蛋白表達變化。結果顯示ECRG4組Hep-2細胞胞核中NF-κB p65蛋白表達水平較Control組及 Vector組顯著下調(P＜0.01)，見圖4A;ECRG4組Hep-2細胞胞漿中NF-κB p65蛋白表達水平較Control組及Vector組顯著上調，見圖4B。

圖2 各組Hep-2細胞遷移能力Fig.2 Migration ability of Hep-2 cells in each group

圖3 各組Hep-2細胞侵襲能力Fig.3 Invasion ability of Hep-2 cells in each group

2.5 ECRG4對Hep-2細胞EMT的影響

將ECRG4過表達質粒及空載體對照質粒轉染Hep-2細胞，Western Blot檢測轉錄因子 Snail、EMT上皮標志物E-cadherin、EMT間質標志物N-cadherin、Vinmentin蛋白水平。結果顯示，與Control組及Vector組相比，ECRG4組轉錄因子Snail蛋白表達顯著下調(P＜0.01)，見圖5A;上皮標志物E-cadherin蛋白顯著上調(P＜0.01)，見圖5B;EMT間質標志物N-cadherin、Vinmentin蛋白表達顯著下調，見圖6A和圖6B。

3 討論

惡性喉鱗癌是一類具有高度侵襲性、預后狀況差的頭頸部腫瘤，ECRG4在喉癌組織及細胞中呈現低表達。在本課題組前期研究中，ECRG4在喉癌組織及癌旁組織樣本中均表達，但喉癌組織中ECRG4表達水平較癌旁組織顯著降低;同時檢測喉癌上皮細胞系Hep-2與LSC-1中ECRG4的表達，發現Hep-2細胞中ECRG4的表達水平顯著低于LSC-1細胞［10］，故本實驗選用ECRG4本底水平較低的Hep-2細胞系作為轉染細胞進行后續研究，保障了實驗的進行。

圖4 ECRG4對各組Hep-2細胞胞核與胞漿中NF-κB p65蛋白表達的影響Fig.4 Effects of ECRG4 on the expression of NF-κ B p65 protein in nucleus and cytoplasm

圖5 ECRG4對各組Hep-2細胞Snail與E-cadherin蛋白表達的影響Fig.5 Effect of ECRG4 on the expression of Snail and E-cadherin protein in Hep-2 cells

為了確定ECRG4對喉鱗癌Hep-2細胞侵襲轉移的作用，將ECRG4過表達質粒轉染Hep-2細胞，細胞劃痕和Transwell檢測細胞遷移和侵襲能力，結果表明ECRG4可明顯抑制Hep-2細胞的遷移和侵襲，進一步驗證ECRG4是潛在的腫瘤候選抑制基因。

圖6 ECRG4對各組Hep-2細胞N-cadherin與Vinmentin蛋白表達的影響Fig.6 Effects of ECRG4 on the expression of N-cadherin and Vinmentin protein in Hep-2 cells

上皮間質轉化(EMT)是上皮細胞從有極性不能移動的上皮細胞通過極性改變和細胞黏附力喪失等一系列變化轉化為間質細胞，增加細胞遷移和侵襲能力的過程。EMT在Wnt、Notch等相關信號通路的作用下激活下游相關轉錄因子Snail、Twist或者ZEB，抑制上皮標志基因E-鈣黏蛋白(E-cadherin)的轉錄，促進間質標記基因Vinmentin與N-cadherin 的表達［11－12］。有研究表明激活 NF-κB 信號通路可上調轉錄因子Snail的表達，抑制EMT上皮標志基因E-cadherin的表達進而促進肝膽管癌細胞的遷移和侵襲［13］;在肺癌細胞A549中，大黃素通過抑制NF-κB信號通路進而抑制ATP誘發的細胞的 EMT、遷移和侵襲［14］;有報道指出，抑制EMT可抑制喉鱗癌細胞的遷移和侵襲［15］。為了驗證ECRG4是否通過 NF-κB/Snail信號通路影響EMT的發生，本研究通過Western blot方法檢測了NF-κB信號通路相關蛋白NF-κB p65在胞漿和胞核中的表達以及轉錄因子Snail、EMT上皮標志基因E-cadherin、EMT間質標志基因Vinmentin與N-cadherin的表達。結果顯示，過表達ECRG4可明顯下調胞核中NF-κB p65蛋白表達，上調胞漿中NF-κB p65的表達，說明ECRG4可顯著抑制 NF-κB p65轉位入核而抑制NF-κB信號通路;過表達ECRG4可明顯下調轉錄因子Snail，并可下調EMT間質標志基因Vinmentin與N-cadherin的蛋白表達、上調EMT上皮標志基因E-cadherin的蛋白表達，顯著抑制EMT發生。

綜合以上結果表明，ECRG4可能通過抑制NF-κB/Snail信號通路活性阻滯EMT的發生進而抑制 Hep-2細胞的侵襲轉移。本研究明確了ECRG4對喉鱗癌侵襲轉移的影響及其相關分子作用機制，為ECRG4在喉鱗癌發生發展中的作用及相關分子機制提供了新的有力證據，揭示ECRG4可能成為喉鱗癌基因治療的潛在新靶點。