蛹蟲草多糖對(duì)衰老小鼠抗氧化水平及小鼠H22瘤組織Bcl-2、Bax mRNA表達(dá)的影響*＊

郭麗新，鐘 文，姜 玲

(黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江哈爾濱 150040)

蛹蟲草［Cordyceps militaris(L.)Link］與冬蟲夏草同屬異種，《全國(guó)中草藥匯編》記載蛹蟲草子實(shí)體及蟲體可作冬蟲夏草入藥。蛹蟲草多糖(Cordyceps militarispolysaccharides，CMPS)是蛹蟲草最重要的活性成分之一，能有效抑制自由基的氧化反應(yīng)，具有抗氧化及抗衰老作用，有研究顯示，蛹蟲草可在一定程度上減輕酒精、環(huán)磷酰胺所致的肝損傷［1－4］。衰老模型的建立、衰老的機(jī)制以及對(duì)抗衰老藥物亦是當(dāng)前熱點(diǎn)研究課題之一，目前，有對(duì)衰老模型小鼠進(jìn)行蛹蟲草粉溶液灌胃、蛹蟲草菌株的發(fā)酵菌絲體粉混懸液等的研究，也有蛹蟲草胞外粗多糖液灌胃給藥對(duì)衰老小鼠巨噬細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)存在的過氧化狀態(tài)影響的研究等［5－7］，但缺乏CMPS對(duì)衰老模型小鼠體內(nèi)抗氧化，延緩衰老等作用的研究。細(xì)胞凋亡是由體內(nèi)外因素觸發(fā)細(xì)胞內(nèi)預(yù)存的死亡程序而導(dǎo)致的細(xì)胞死亡過程，其生物學(xué)作用主要在于清除無用的細(xì)胞、發(fā)育不正常的細(xì)胞、已完成任務(wù)的細(xì)胞及有害的細(xì)胞，在器官、組織的形成與成熟，以及心血管病變、神經(jīng)性病變，腫瘤的形成等方面發(fā)揮作用;瘤組織B-淋巴細(xì)胞瘤-2(Bcl-2)可以通過改變線粒體的膜電位等而抑制細(xì)胞凋亡，而B-淋巴細(xì)胞瘤-2相關(guān)X(Bax)則是一種促凋亡基因，可與Bcl-2結(jié)合成二聚體，影響細(xì)胞的凋亡［8－10］。本研究通過探討CMPS對(duì)D-半乳糖所致衰老模型小鼠肝組織超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、過氧化氫酶(catalase，CAT)、丙二醛(malondialdehyde，MDA)水平的影響，及對(duì)小鼠H22瘤組織Bcl-2、BaxmRNA表達(dá)的影響，為CMPS抗氧化、抗衰老及抗腫瘤的應(yīng)用等提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、藥品及儀器

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為ICR小鼠，清潔級(jí)，體質(zhì)量(20±2)g，由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。藥品為CMPS注射液(50 g/L，黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)生化教研室制備)，D-gal(上海試劑二廠，用生理鹽水配制為30 g/L溶液)，SOD、CAT、MDA 試劑盒(南京建成生物工程研究所)，H22小鼠肝癌細(xì)胞株購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫，Bcl-2抗體、Bax抗體(Cell Signaling)。設(shè)備為酶標(biāo)儀imark(BIO-Rad，美國(guó))，PCR擴(kuò)增儀(Biorad)。

1.2 方法

1.2.1 CMPS對(duì)衰老小鼠抗氧化水平的影響 將ICR小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組、CMPS高劑量組、CMPS中劑量及CMPS低劑量組，每組15只。模型組及3個(gè)劑量CMPS組小鼠每天給予0.3 g/kg D-半乳糖溶液頸部皮下注射構(gòu)建衰老模型;同時(shí)，模型組小鼠給予0.033 g/kg生理鹽水肌肉注射，CMPS高、中及低劑量組小鼠分別給予100、50及25 mg/kg CMPS大腿外側(cè)肌肉注射(1次/d)，對(duì)照組按等量生理鹽水頸部及大腿外側(cè)肌肉注射。動(dòng)物正常飼養(yǎng)，每日記錄小鼠行動(dòng)、進(jìn)食、飲水、生長(zhǎng)、發(fā)育、毛色等情況。連續(xù)注射6周，采集小鼠血液，麻醉狀態(tài)下脊椎斷臼法處死實(shí)驗(yàn)小鼠，腹部消毒，剪開皮膚和腹膜，剝離出肝臟，生理鹽水清洗，肝臟稱重，制備成肝勻漿液。按試劑盒說明測(cè)定肝勻漿液的SOD、CAT、MDA含量。

1.2.2 CMPS對(duì)小鼠H22瘤組織Bcl-2、BaxmRNA表達(dá)的影響 30只H22腋下移植瘤小鼠，隨機(jī)分為模型組、CMPS中劑量組及CMPS低劑量組，每組10只。小鼠移植瘤模型建立后第2天，模型組小鼠腹腔注射0.2 mL生理鹽水;CMPS中、低劑量組小鼠分別注射50、25 mg/kg的CMPS(1次/d)，連續(xù)10 d。第10天時(shí)，取瘤組織，提取RNA，參考文獻(xiàn)［8－10］，采用 RT-PCR 法檢測(cè)Bcl-2、BaxmRNA表達(dá)水平，以β-actin作為內(nèi)參照，計(jì)算Bcl-2、BaxmRNA的相對(duì)表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 11.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，組間數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用Dunnett-t檢驗(yàn)，P＜0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CMPS對(duì)衰老小鼠抗氧化水平的影響

2.1.1 小鼠一般狀態(tài) 觀察可見，對(duì)照組小鼠行動(dòng)敏捷，進(jìn)食飲水無異常，生長(zhǎng)發(fā)育狀況良好，毛順滑有光澤;D-半乳糖誘導(dǎo)的衰老模型小鼠活動(dòng)減少，精神萎靡，倦怠嗜睡，行動(dòng)遲緩，形體瘦弱，體力較弱，皮毛松散，毛色枯槁缺乏光澤，皮膚彈性差，進(jìn)食明顯減少等衰老體征;CMPS組小鼠與模型組比較，活動(dòng)量相對(duì)增加，活力更強(qiáng)，生長(zhǎng)發(fā)育狀況與精神狀況較好，皮毛滑順有光澤。

2.1.2 小鼠肝臟SOD、CAT及MDA活性 注射6周后，與對(duì)照組比較，模型組小鼠肝組織SOD、CAT活性下降，MDA含量升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);與模型組比較，3個(gè)CMPS劑量組小鼠肝組織SOD、CAT活性顯著升高，MDA含量顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＜0.05);隨著CMPS劑量的增加，SOD、CAT活性呈升高趨勢(shì)，MDA含量呈降低趨勢(shì)，但兩兩比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。表明CMPS可提高小鼠肝組織SOD、CAT活性、降低小鼠肝組織MDA含量，減弱自由基致衰老的損傷效應(yīng)。見表1。

表1 CMPS對(duì)小鼠肝臟SOD、CAT、MDA活性比較Tab.1 Comparison of SOD，CAT and MDA activity of CMPSon livers of rats

2.2 CMPS對(duì)H22瘤組織Bcl-2、Bax mRNA表達(dá)水平的影響

結(jié)果顯示，與模型組比較，CMPS兩個(gè)劑量組H22瘤組織Bcl-2 mRNA表達(dá)水平顯著降低，BaxmRNA的表達(dá)水平顯著升高(P＜0.05);與CMPS低劑量組比較，CMPS中劑量組變化更明顯(P＜0.05)。見圖 1、表 2。

圖1 H22瘤組織Bcl2、Bax及β-actin mRNA RT-PCR電泳結(jié)果Fig.1 Electrophoretic results of Bcl2，Bax and β-actin RT-PCR in H22 tumor tissues

表2 H22荷瘤小鼠Bcl-2及Bax mRNA相對(duì)表達(dá)量Tab.2 Relative expression of Bcl-2 Bax mRNA in H22 tumor-bearing rats

3 討論

衰老是機(jī)體各細(xì)胞、組織、器官功能進(jìn)行性下降的過程。關(guān)于衰老發(fā)生機(jī)制，在諸多學(xué)說中，氧自由基學(xué)說是目前比較公認(rèn)的機(jī)制之一［11］。D-半乳糖亞急性衰老模型是常用的動(dòng)物衰老模型建立方法，也是研究抗衰老藥物的經(jīng)典模型，此方法簡(jiǎn)便而較易實(shí)現(xiàn)、價(jià)格相對(duì)低廉、結(jié)果穩(wěn)定性強(qiáng)，在抗衰老藥物研究等領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用［11－17］。機(jī)體代謝會(huì)產(chǎn)生自由基，但同時(shí)又存在有效的清除自由基的代謝過程，二者維持相應(yīng)的平衡。SOD幾乎存在于所有生物細(xì)胞中，是重要的抗氧化酶，能夠清除氧自由基，而其活性大小又可反映機(jī)體清除自由基能力，CAT存在于細(xì)胞過氧化物體內(nèi)并保護(hù)機(jī)體免受有害物質(zhì)損傷［18－20］，其抗衰老機(jī)制是 SOD催化超氧化物通過歧化反應(yīng)轉(zhuǎn)化為O2和H2O2，生成的H2O2可進(jìn)一步由CAT催化分解為H2O和O2。H2O2正常情況下可參與甲狀腺中活性碘的生成，在中性粒細(xì)胞中殺死被吞噬的細(xì)菌，亦可使過氧化物(ROOH)轉(zhuǎn)變?yōu)闊o毒的醇類，但H2O2增多會(huì)產(chǎn)生毒性反應(yīng)，使酶失活，膜功能受損，生成脂褐素顆粒，與組織老化有關(guān)。當(dāng)機(jī)體清除自由基的能力由于年齡的增長(zhǎng)等而下降時(shí)，可表現(xiàn)為SOD等酶活力下降，清除自由基的能力減弱，過量的自由基引起DNA損傷，細(xì)胞膜上的不飽和脂肪酸產(chǎn)生脂質(zhì)過氧化反應(yīng)等，引起細(xì)胞衰老［21－22］。MDA是發(fā)生脂質(zhì)過氧化反應(yīng)最重要的代謝產(chǎn)物之一，測(cè)定其含量高低可間接推斷出自由基對(duì)機(jī)體損傷的程度［23］。

本研究通過建立D-半乳糖所致衰老模型小鼠，探討CMPS對(duì)其延緩衰老的作用及機(jī)制。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，對(duì)照組小鼠行動(dòng)敏捷，進(jìn)食飲水無異常，生長(zhǎng)發(fā)育狀況良好，毛順滑有光澤;而D-半乳糖誘導(dǎo)的衰老模型小鼠活動(dòng)減少，精神萎靡，倦怠嗜睡，行動(dòng)遲緩，形體瘦弱，體力較弱，皮毛松散，毛色枯槁缺乏光澤，皮膚彈性差，進(jìn)食明顯減少等衰老體征;給予CMPS后，與模型組比較，CMPS組小鼠活動(dòng)量相對(duì)增加，活力更強(qiáng)，生長(zhǎng)發(fā)育狀況與精神狀況較好，皮毛滑順有光澤。注射6周后，與對(duì)照組比較，模型組小鼠肝組織SOD、CAT活性顯著下降，MDA含量顯著增加 (P＜0.05);與模型組比較，3個(gè)CMPS劑量組小鼠肝組織SOD、CAT活性顯著升高，MDA含量降低，具有顯著性差異(P＜0.05)。表明CMPS可提高小鼠肝組織SOD、CAT活性、降低小鼠肝組織MDA含量，減弱自由基致衰老的損傷效應(yīng)。

腫瘤的發(fā)生發(fā)展是一個(gè)多因素相互作用以及多階段的復(fù)雜過程。其中細(xì)胞凋亡與腫瘤細(xì)胞的發(fā)生發(fā)展有密切關(guān)系。Bcl-2可以通過改變線粒體的膜電位等而抑制細(xì)胞凋亡［8－9］。Bax則是促凋亡基因，可與Bcl-2結(jié)合成二聚體，影響細(xì)胞的凋亡［10］。本課題組在前期通過電鏡技術(shù)觀察小鼠H22瘤組織的超微結(jié)構(gòu)改變，觀察到CMPS作用后小鼠H22瘤組織細(xì)胞出現(xiàn)早期凋亡改變，腫瘤組織內(nèi)有凋亡細(xì)胞存在，顯示CMPS具有誘導(dǎo)小鼠H22肝癌細(xì)胞凋亡作用［24］，本研究結(jié)果顯示，CMPS作用后，H22瘤組織Bcl-2 mRNA相對(duì)表達(dá)量下降，BaxmRNA相對(duì)表達(dá)量增加(P＜0.05)，與CMPS低劑量組比較，CMPS中劑量組變化更明顯(P＜0.05)。提示CMPS可能通過氧化應(yīng)激及調(diào)控凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、Bax的mRNA表達(dá)水平參與H22荷瘤小鼠腫瘤細(xì)胞凋亡過程，對(duì)腫瘤的防治具有進(jìn)一步研究的價(jià)值。

綜上，CMPS能清除衰老小鼠肝臟的氧自由基，增強(qiáng)抗氧化能力，保護(hù)肝細(xì)胞;同時(shí)CMPS還可抑制脂質(zhì)過氧化，減輕自由基對(duì)細(xì)胞、組織等的嚴(yán)重?fù)p害，減弱其致衰老等的損傷效應(yīng)。CMPS可能通過調(diào)控凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、Bax的mRNA表達(dá)水平參與腫瘤細(xì)胞凋亡過程，對(duì)腫瘤的防治具有進(jìn)一步研究的價(jià)值。