貴州地區非阻塞性無精癥與SIRPA-SIRPG基因rs6080550多態性的相關性*＊

王嬋娟，何 燕，張 婷，王治海，禹文峰，官志忠，安 宇

(1.貴州醫科大學 地方病與少數民族疾病教育部重點實驗室，貴州 貴陽 550004;2.貴州省醫學分子生物學重點實驗室，貴州 貴陽550004;3.貴州省人民醫院中心實驗室，貴州貴陽 550002)

我國孕齡期夫妻不孕不育的發生率大約為15%～20%，因男方因素導致的不孕不育約為50%，其中無精癥是造成男子不育的重要原因之一，約占不育男性的15%［1］。無精癥可分為阻塞性無精癥(obstructive azoospermic，OA)和非阻塞性無精癥(non-obstructive azoospermic，NOA)，其中非阻塞性無精癥是指男性睪丸生精細胞發生萎縮退化不能產生精子［2］。已有研究顯示男性非阻塞性無精癥中精子的生成障礙與Y染色體微缺失、X染色體與常染色體的基因突變以及減數分裂遺傳重組缺陷有關［3－4］，隨著芯片技術的發展，全基因組關聯研究(Genome-wide association study，GWAS)成為一種有效的研究復雜疾病發病基因及其位點的手段，它主要通過對大樣本人群DNA樣本進行全基因組高密度單核苷酸多態性(single nucleotide polymorphism，SNP)位點分型，從而揭示與疾病發生相關的遺傳位點［5］。目前已有少數研究通過GWAS找到了一些可能與非阻塞性無精癥相關的基因區域，并在后續相關的SNP與非阻塞性無精癥的相關研究中探討這些SNP與無精癥的關聯［6］，信號調節蛋白α(SIRPA)和信號調節蛋白γ(SIRPG)蛋白編碼區則是其中之一，已有的研究表明 SIRPA和SIRPG蛋白編碼區的突變和無精癥風險性相關，rs6080550(C/T)則是其中一個多態位點;SIRP是信號調節蛋白家族，是受體膜上的糖蛋白，參與了負向調節受體酪氨酸激酶的級聯過程，但其基因在精子生成中的作用目前尚未見報道。本研究選取rs6080550作為研究靶點，以貴州地區非阻塞性無精癥患者和正常男性健康對照人群為研究對象，探討該位點的多態性與貴州非阻塞性無精癥的相關性，以期為貴州人群非阻塞性無精癥的診斷及預防提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 對象

在知情同意的原則下隨機選取臨床確診的非阻塞性無精癥患者145例［(46.5±20.2)歲］及正常男性健康體檢人群174例［(48.3±12.9)歲］，分為疾病組及對照組。疾病組平均不育年限4.5年，臨床檢查已排除精索靜脈曲張、生殖道梗阻、隱睪、附睪損傷等其他泌尿生殖系統疾患，且無特殊病史及家族史，經精液檢查，均確診為非阻塞性無精癥。

1.2 試劑與儀器

人基因組rs6080550(C/T)SNP位點TaqMan探針分型試劑盒(TaqMan SNP Genotyping Assays，美國應用生物系統公司)，TaqMan Genotyping Master Mix(美國應用生物系統公司)，NanoDropTMLite分光光度計(美國Thermo Fisher公司，ABI stepone Plus Real-time PCR儀(美國應用生物系統公司)。

1.3 基因組DNA提取及定量

對研究人群全血采用酚/氯仿抽提法抽提基因組DNA，NanoDropTMLite分光光度計測量DNA的濃度及純度，將每個DNA樣本統一稀釋成濃度為20μg/L的應用液。

1.4 SIRPA-SIRPG基因rs6080550(C/T)SNP位點基因分型

對研究人群采用人基因組rs6080550(C/T)SNP位點TaqMan探針分型試劑盒進行基因分型，ABI Stepone Plus Real-time PCR儀進行PCR擴增。PCR擴增總體積10μL，包含2×TaqMan Genotyping Master Mix 5 μL、40×TaqMan SNP Genotyping Assay Mix 0.25 μL、DNA 模板 1.5 μL、ddH2O 3.25 μL。PCR反應條件為:95℃熱變性10 min，92℃變性15 s，60℃退火1 min，共30個循環。使用StepOne Software v2.1軟件，讀取熒光信號，通過X、Y軸散點圖分析及測序結果確定樣本的基因型。

1.5 統計學分析

采用SPSS17.0統計軟件處理數據，直接計數法統計位點的基因型頻率和等位基因頻率，組間基因型頻率和等位基因頻率比較采用χ2檢驗，設定P＜0.05時差異有統計學意義。

2 結果

2.1 SIRPA-SIRPG基因rs6080550位點基因型及等位基因頻率

對照組人群基因型頻率分布符合Hardy-Weinberg平衡(P=1.0)。疾病組及對照組基因型與等位基因頻率分布的卡方檢驗結果如表1所示。rs6080550(C/T)基因型及等位基因頻率分布，在疾病組與對照組比較差異具有統計學意義(P＜0.05)。疾病組TT基因型及T等位基因頻率均顯著高于對照組(P＜0.05)。

表1 SIRPA-SIRPG基因rs6080550基因型和等位基因頻率分布(n，%)Tab.1 Frequency distribution of rs6080550 genotypes and alleles in SIRPA-SIRPG gene

2.2 SIRPA-SIRPG基因rs6080550位點基因型頻率與非阻塞性無精癥的患病風險

SIRPA-SIRPG基因rs6080550位點基因型頻率與非阻塞性無精癥的相關性分析見表2。基因型頻率結果顯示rs6080550(T/T)增加人群中的非阻塞性無精癥患病風險，OR=13.52，P＜0.05。

表2 rs6080550基因型頻率與非阻塞性無精癥患病風險的關系Tab.2 Relationship between rs6080550 genotype frequency and risk of non-obstructive azoospermia

3 討論

男性非阻塞性無精癥的主要原因是精子生成障礙，精子發生是精原細胞相繼分化成初級精母細胞、次級精母細胞及精子細胞，并最終形成成熟精子的過程，任何一個環節出現異常都可能導致精子發生停滯，從而導致無精癥。目前已有的研究顯示男性非阻塞性無精癥中精子的生成障礙與Y染色體微缺失、Y染色體gr/gr缺失、X染色體與常染色體的基因突變以及減數分裂遺傳重組缺陷有關［3－4］。

SNP是指在基因組水平上由單個核苷酸的變異所引起的DNA序列多態性，它是人類可遺傳的變異中最常見的一種。據研究揭示，與精子發生相關的基因大約有2 300多個［7］，而基因異常通常被認為是非阻塞性無精癥的一個主要風險因素［8］，一直以來關于精子發生相關的基因如FKBP6、蛋白質精氨酸甲基轉移酶(PRMT6)、過氧化體生物合成因子10(PEX10)、轉錄因子SOX5(SOX5)、芳香化酶19(CYP19)等基因的SNP多態性與非阻塞性無精癥相關的研究報道層出不窮［9－13］。大量研究致力于通過現代測序技術和大規模的基因芯片技術尋找導致非阻塞性無精癥新的易感基因，但是，超過50%的無精癥的致病因素仍未可知［14］。

近年來，GWAS為非阻塞性無精癥與易感基因SNP多態性的研究提供了更好的依據，南京醫科大學胡志斌教授團隊在Nature Genetics上發表了一篇在中國人群中和非梗阻性無精癥相關的GWAS研究文章，研究中選取1 000例無精癥病人和1 703例對照對906 703 SNPs進行了分析，鎖定了一些與非阻塞性無精癥可能關聯的基因區域和位點［6］，SIRPA-SIRPG基因 6080550(C/T)即是其中之一。本次研究選擇貴州地區人群，在貴州非阻塞性無精癥患者和正常男性健康體檢人群共319例樣本中對GWAS報道的SIRPA-SIRPG基因rs6080550(C/T)進行了進一步的驗證分析，探討該位點的多態性與非阻塞性無精癥的相關性，為貴州人群非阻塞性無精癥的診斷及預防干預提供一定的理論依據。

本次結果顯示rs6080550基因型分布在非阻塞性無精癥疾病組和對照組中差異有統計學意義，疾病組rs6080550(TT)基因型頻率顯著高于對照組，該位點T等位基因頻率在疾病組中的分布也明顯高于對照組。同時，對該位點3種基因型患病風險OR值的評估中，rs6080550(TT)基因型OR值為13.52，遠大于1(P＜0.05)，結果顯示攜帶TT基因型可能增加非阻塞性無精癥的患病風險，可能是疾病的危險因素。對比目前國內外對該位點的研究，日本曾對490例非阻塞性無精癥患者及對照進行了基因分型分析，所得結果顯示rs6080550位點基因的多態性與無阻塞性無精癥并沒有顯著相關性，rs6080550位點多態性并非無精癥的危險因素(OR=0.96)［15］;國內上海交通大學醫學院也對胡志斌教授團隊報道的位點進行了驗證實驗，也未得到SIRPA-SIRPG基因6080550(C/T)位點與非阻塞性無精癥相關的結果［16］。而本次對貴州人群的研究得到的結果與GWAS研究結果一致，rs6080550基因多態與非阻塞性無精癥相關。鑒于目前對該位點研究結果存在的爭議，可能需要更大的獨立集合的病例對照樣本進行進一步研究，對結果的確定可能還需要更大的人群樣本作為分析基礎。