復方鱉甲軟肝片對小鼠腎纖維化的防治作用*＊

熊 英，劉宗澤，李佑敬，王 嵐，秦 臻，許鍵煒

(1.貴州醫科大學機能實驗室，貴州貴陽 550025;2.貴州省黎平縣人民醫院急診科，貴州黎平 557300;3.貴州省從江縣人民醫院外科，貴州從江 557400;4.貴州醫科大學醫學科學研究所，貴州貴陽 550004;5.貴州醫科大學 藥理學教研室，貴州 貴陽 550025;6.貴州醫科大學組織工程與干細胞實驗中心，貴州貴陽 550004)

糖尿病、細菌或病毒感染、自身免疫功能紊亂、藥物毒害等等原因均能引起腎臟損傷，誘發腎小球腎炎、間質性腎炎、腎病綜合征，還可能進一步導致腎小球硬化、腎間質纖維化或腎小管萎縮，即腎纖維化［1］。每年因腎臟病變發展到腎纖維化甚至腎功能衰、尿毒癥者多達數十萬［2］，給患者造成極大的痛苦，給社會和家庭帶來了巨大的經濟負擔。復方鱉甲軟肝片是臨床用于早期肝硬化治療的中藥制劑，具有較好的抗肝纖維化作用［3］。在復方鱉甲軟肝片治療藥物誘導的小鼠肝纖維化的研究中發現，毒性物質CCl4不僅對實驗動物肝臟有致纖維化作用，對其腎臟亦具有較強損害并可導致腎纖維化，且復方鱉甲軟肝片對于腎纖維化有一定的干預作用。2018年2～9月通過建立CCl4致腎纖維化小鼠模型，并予以復方鱉甲軟肝片治療，旨在觀察復方鱉甲軟肝片對小鼠腎纖維化的防治作用，并初步探討其作用機制，為該藥物用于腎纖維化治療提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗藥品、動物 復方鱉甲軟肝片由內蒙古福瑞醫療科技股份有限公司生產，批準文號為國藥準字Z19991011。SPF級昆明種小鼠40只，體質量約(20±2)g，由貴州醫科大學實驗動物中心提供，合格證號SCXK(黔)2018－0001，分籠飼養，每籠5只，動物室通風良好，室溫15～20℃。

1.1.2 主要試劑 Masson染色試劑盒、磷酸緩沖液(PBS)、EDTA抗原修復緩沖液(PH9.0)、蘇木素均購自武漢金開瑞生物科技有限公司，兔抗小鼠α-SMA(ab32575)及TNF-α多克隆抗體(ab6671)購自美國Abcam公司，辣根過氧化物酶標記山羊抗兔二抗及抗體稀釋液購自武漢博士德公司，BSA(A8020)購自Solarbio公司，免疫組化試劑盒DAB顯色劑(DAKO，丹麥)。

1.2 方法

1.2.1 動物分組及腎纖維化模型的制備 40只昆明種小鼠適應性飼養3 d后，隨機分為對照組、模型組、復方鱉甲軟肝片治療組(簡稱治療組)、復方鱉甲軟肝片干預組(簡稱干預組)，每組10只，雌雄各半。腎纖維化動物模型的建立:模型組、治療組、干預組均皮下注射CCl4與橄欖油等體積混合液［4－5］，劑量 0.03 mL/10 g 體質量，每周 2 次(固定于每周一和周四下午14∶00時給藥)，持續6周;對照組以等體積橄欖油皮下注射，方法同實驗組。造模6周后，各組分別隨機取2只小鼠處死，取腎臟行病理檢查判斷造模情況。造模成功的判斷標準:腎組織切片HE染色光鏡下出現腎小球肥大、節段性硬化或全球硬化、腎小管上皮細胞濁腫或空泡變性，腎小管出現明顯的擴張或萎縮，伴炎性細胞浸潤，腎間質水腫或纖維化。

1.2.2 給藥方式 治療組于最后一次造模后24 h，灌胃給予復方鱉甲軟肝片，劑量為1 g/(kg·d)，連續給藥6周(藥物用生理鹽水配成50 g/L濃度，給藥體積為0.1 mL/10 g體質量，每日2次);干預組在造模的同時即開始給與復方鱉甲軟肝片，給藥途徑、劑量、方法同治療組，連續給藥12周;模型組和對照組在造模6周后則以等體積生理鹽水灌胃。此外，為了維持腎纖維化模型狀態，模型組、治療組和干預組小鼠在造模成功后每周予CCl4橄欖油液皮下注射1次，劑量0.03 mL/10 g體質量，直至治療結束;對照組則代以等體積橄欖油皮下注射。

1.2.3 一般情況觀察及腎功能、腎纖維化指標檢測 觀察各組動物精神狀態、飲食、皮毛、大、小便等一般情況，并每兩周稱量體質量;在治療或干預結束后，各組動物稱量體質量，并腹腔注射4% 水合氯醛0.1 mL/10 g體質量，麻醉后摘眼球取血，檢測血清尿素氮(blood urea nitrogen，BUN)、肌酐(serum creatinine，Scr)水平，ELISA 法檢測血清透明質酸(Hyaluronic Acid，HA)、層黏連蛋白(laminin，LN)、Ⅲ型前膠原(procollagen Ⅲ，PC Ⅲ)、Ⅳ型膠原(Collagen typeⅣ，Ⅳ-Col)。

1.2.4 腎臟組織病理學觀察 取血后處死動物，取雙側腎臟稱重，測算臟器指數，取左腎以4% 中性甲醛固定24 h，常規脫水、透明、浸蠟、包埋，制成4.0μm薄片，按常規方法行HE染色及Masson染色，光學顯微鏡下觀察腎臟組織病理學改變。

1.2.5 免疫組織化學染色 免疫組織化學法檢測腎臟組織α-平滑肌動蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)和腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor-α，TNF-α)的表達。石蠟切片制備同“1.2.4”項，于60℃烤箱內烤片60 min，二甲苯和梯度酒精常規脫蠟水化，用EDTA抗原修復緩沖液(pH9.0)微波爐中進行抗原修復，待自然冷卻后PBS洗滌3次，每次5 min，3%H2O2孵育，阻斷內源性過氧化物酶活性，PBS中洗滌3次(方法同前)，3%BSA室溫封閉 30 min，分別滴加抗 α-SMA(1∶200)、抗TNF-α(1∶200)一抗，常溫孵育 2 h，PBS 中洗滌，滴加二抗，常溫孵育30 min，PBS洗滌，DAB溶液顯色，蘇木素復染，常規脫水、透明、中性樹膠封片。光學顯微鏡下觀察。

1.3 統計學分析

應用SPSS 17.0統計軟件對數據進行統計分析。所得數據以均數±標準差(±s)表示，多組間比較采用單因素方差分析，多重比較采用LSD法，體質量監測數據采用重復測量的方差分析;P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 一般情況

各組小鼠無死亡，造模6周時治療組、干預組和模型組小鼠活動及進食量較造模前減少、也少于6周時的對照組小鼠;治療組和模型組小鼠毛色明顯晦暗，精神萎靡，小便黃，大便黃、稀軟、偶爾不成形。造模6周時各組體質量均有不同程度的增長，但治療組和模型組體質量明顯小于對照組(P＜0.05);干預組體質量、精神、食量及毛色、大小便等接近于對照組，明顯優于治療組和模型組。治療組行復方鱉甲軟肝片治療6周后精神、食量及毛色逐漸好轉，小便略黃，大便呈顆粒狀，體質量增長快于模型組(P＜0.05)，其他一般情況趨近于對照組。見表1。

表1 各組小鼠體質量( ± s，g)Tab.1 Changes of mice in all groups

表1 各組小鼠體質量( ± s，g)Tab.1 Changes of mice in all groups

(1)與模型組比較，P＜0.05

組別 造模前造模2周 4周 6周 8周 10周 12周對照組 20.20±1.21 28.25±2.21 34.10±2.10(1)38.10±1.90(1)41.11±2.66(1)42.35±2.36(1)45.78±2.58(1)模型組 20.76±1.58 23.55±2.87 26.19±2.68 29.44±2.56 32.78±2.32 33.49±2.14 36.90±1.98治療組 21.17±2.36 24.12±2.45 27.75±2.23 30.33±2.73 34.66±3.20(1)37.54±2.68(1)41.10±2.54(1)干預組 20.48±2.80 26.90±3.64 29.37±2.75 32.26±2.47(1)36.45±3.47(1)39.02±1.12(1)42.86±2.34(1)

2.2 臟器指數

與對照組比較，模型組小鼠腎臟指數顯著增高。治療組和干預組腎臟指數低于模型組(P＜0.05)，趨近于對照組。見表2。

表2 第12周時各組小鼠腎臟指數±s)Tab.2 Renal index of mice in all groups in week 12

表2 第12周時各組小鼠腎臟指數±s)Tab.2 Renal index of mice in all groups in week 12

(1)與模型組比較，P＜0.05

指標 對照組 模型組 治療組 干預組體質量(g) 45.78±2.58 36.90±1.98 41.10±2.54 42.86±2.34腎臟濕重(g) 0.82±0.02 1.12±0.10 0.94±0.06 0.86±0.04腎臟指數 1.79±0.02(1) 3.03±0.03 2.29±0.02(1) 2.01±0.02(1)

2.3 血清BUN及Scr

與對照組相比，模型組血清BUN和Scr均有明顯的增高(P＜0.05)，干預組BUN和Scr顯著低于模型組(P＜0.05);治療6周后，治療組血清BUN和Scr逐漸恢復，接近對照組，與模型組比較，差異有統計學意義(P＜0.05)。見表3。

表3 治療6周時各組小鼠血清BUN和Scr水平(±s)Tab.3 Serum BUN and Scr levels of mice in all groups in week 12

表3 治療6周時各組小鼠血清BUN和Scr水平(±s)Tab.3 Serum BUN and Scr levels of mice in all groups in week 12

與模型組比較，(1)P＜0.05，(2)P＜0.01

組別 BUN(mmol/L) Scr(μmol/L)對照組 8.01±2.62(1) 31.52±7.21(2)模型組 18.21±3.56 91.59±8.95治療組 11.34±3.81(1) 43.62±11.43(2)干預組 10.35±3.22(1) 39.27±8.21(2)

2.4 腎纖維化指標

與對照組比較，模型組小鼠血清中的HA、LN、PC III、Ⅳ-Col明顯增高(P＜0.05);治療組、干預組小鼠經復方鱉甲軟肝片治療或干預后，上述纖維化指標明顯低于模型組(P＜0.05)。見表4。

2.5 腎臟組織學

HE染色可見，模型組的腎組織出現廣泛水腫，腎小球明顯肥大、部分腎小球出現節段性硬化或全球硬化、腎小管上皮細胞濁腫、空泡變性，部分腎小管出現明顯的擴張或萎縮，大量的炎性細胞浸潤，腎間質水腫或纖維化;治療組經復方鱉甲軟肝片治療6周后上述病理學改變顯著改善;干預組腎小球肥大和小管細胞病變不明顯。腎臟石蠟切片Masson染色檢測顯示:模型組可見較多染成藍色的膠原纖維，主要分布于球管區附近;治療組中藍色的膠原纖維逐漸減少，提示腎纖維化程度逐漸減輕;干預組腎纖維化病變不明顯。見圖1。

表4 治療6周時各組小鼠血清HA、LN、PC III及Ⅳ-Col水平( ± s，μg/L)Tab.4 Serum HA，LN，PC III and IV-Col levels

表4 治療6周時各組小鼠血清HA、LN、PC III及Ⅳ-Col水平( ± s，μg/L)Tab.4 Serum HA，LN，PC III and IV-Col levels

(1)與模型組比較，P＜0.05

指標 對照組 模型組 治療組 干預組HA 138.53±20.44(1) 368.32±47.35 189.55±37.45(1) 155.16±40.87(1)LN 43.78±9.21(1) 110.10±11.24 74.30±12.66(1) 55.67±13.34(1)PCIII 50.23±10.36(1) 85.89±11.97 63.47±12.55(1) 54.56±9.82(1)Ⅳ-Col 42.86±7.23(1) 65.16±9.65 52.66±7.78(1) 52.93±8.77(1)

2.6 腎臟α-SMA、TNF-α蛋白的表達

對照組小鼠腎小球結構完整，腎小管無擴張，胞漿內僅偶有黃染，α-SMA、TNF-α較少陽性表達;模型組小鼠腎臟可見大量黃染，胞漿內α-SMA、TNF-α陽性表達(棕黃色)明顯增強，腎小球萎縮，腎小管塌陷，腎間質水腫、纖維化嚴重;治療組和干預組α-SMA和TNF-α表達較模型組明顯減少。見圖2。

3 討論

腎臟纖維化是各種慢性腎臟疾病進展至終末期腎衰竭的共同通路和主要病理基礎［6］，延緩或逆轉腎纖維化是治療的關鍵。纖維化的發生通常被認為與組織損傷以及創傷愈合的應答反應相關，包括修復、再生、組織塑形等一系列過程。在腎纖維化的病理過程中，正常的腎小管和腎間質結構被大量細胞外基質所代替，并出現大量的肌成纖維細胞，最終表現為腎功能進行性不可逆損害［7］。研究表明，膠原纖維的產生和沉積是纖維化發生的標志［8－9］，HA、LN、PC Ⅲ、Ⅳ-Col是細胞外基質的主要成分，能較好的反映腎間質纖維化的情況［10－11］，其中，HA由間質細胞合成，能反映腎臟纖維化活動程度，是目前抗纖維化治療中的最佳檢測指標;LN是基底膜成分中的主要糖蛋白，主要分布于腎小球基底膜的透明層，能夠與Ⅳ-Col共同作用，維持腎小球基底膜的網狀結構;血清PCⅢ屬于一種間質膠原，能夠誘發纖維性新月體形成;慢性腎功能衰竭患者血清中 LN、PCⅢ、Ⅳ-Col水平異常升高。本實驗中給予CCl4皮下注射6周后，模型組和治療組小鼠腎組織病理切片符合腎纖維化特征，血BUN和Scr較對照組顯著升高，符合腎纖維化疾病特點，進一步，檢測血清HA、LN、PCⅢ和Ⅳ-Col均顯著升高，說明腎纖維化動物模型成立。復方鱉甲軟肝片持續治療6周后，治療組小鼠腎臟組織病理變化明顯改善，腎臟指數、血BUN、Scr以及上述纖維化指標顯著下降(P＜0.05)，說明該藥物能夠有效逆轉CCl4引起的腎臟損傷，減少腎臟膠原的產生。干預組予造模同時灌胃復方鱉甲軟肝片干預，與同期模型組相比腎臟纖維化病變不明顯，上述腎纖維化指標亦明顯低于模型組。說明了藥物能夠一定程度上延緩腎纖維化疾病進程。

圖1 各組小鼠腎臟病理學改變(HE，×40)Fig.1 Renal pathological changes of mice in all groups

圖2 各組小鼠腎組織α-SMA、TNF-α免疫組織化學染色(DAB，×40)Fig.2 Immunohistochemical staining result of renal tissue α-SMA，TNF-α of mice in all groups

研究證實，在纖維化進程中α-SMA是腎間質固有細胞向肌成纖維細胞發生轉化的標志，腎間質細胞活化后能大量分泌膠原形成細胞外基質，細胞外基質的產生和大量沉積是纖維化主要病理特征［12－13］。此外，一些細胞因子如 IL-1、TNF-α、TGF-β 也具有很強的促纖維化作用［14－16］，其中TNF-α除了能夠促進炎癥細胞的聚集、促進成纖維細胞增殖，還能夠與轉化生長因子-β、內皮素-1相互作用共同促進腎間質纖維化的發生［17］。因此，本實驗觀察了腎臟組織中α-SMA和TNF-α的表達情況，結果顯示模型組α-SMA和TNF-α顯著高表達，治療組經治療6周后，腎組織病理變化改善的同時，α-SMA和TNF-α表達明顯低于模型組，干預組也顯著低于模型組。說明該藥物的作用機制與抑制炎癥因子的產生，抑制腎間質固有細胞向肌成纖維細胞轉化，從而減少細胞外基質的生成密切相關。

中醫認為纖維化的根本病機是正虛邪實，其病變部位在脈絡，病機為濕熱、痰結、水滯、血瘀，病情由實而虛、由表而里、由氣入血［18］，這與現代醫學對腎纖維化的認識是一致的。腎臟纖維化過程中的血流動力學的改變、免疫介導凝血機制的激活以及腎臟病理改變與中醫“內結為血瘀”有著驚人的相似。我國中醫藥在腎病的防治上歷史悠久，一些中藥及其提取物具有抗纖維化的作用。復方鱉甲軟肝片以鱉甲為主要成分，輔以莪術、赤芍、當歸、三七等能軟堅散結、化瘀解毒、益氣養血。

綜上，本實驗研究表明了該藥物能有效改善腎纖維化小鼠腎功能指標和組織病理學變化、降低血清中HA、LN、PCⅢ和Ⅳ-Col水平。其機制可能與抑制腎臟損傷過程中炎癥相關因子TNF-α的產生，減輕炎性損傷，同時減少細胞外基質的生成相關。這將為復方鱉甲軟肝片的進一步應用開發提供了新思路和實驗依據。