骨康膠囊組方藥物對成骨細胞SaOS-2增殖分化及礦化的影響*＊

楊 健，李 靖，彭 瀟，董 莉，沈艷珍，李勇軍，席曉嵐＊＊，劉 亭＊＊

(1.貴州醫科大學貴州省藥物制劑重點實驗室/省部共建藥用植物功效與利用國家重點實驗室，貴州 貴陽 550004;2.貴州醫科大學 藥學院，貴州貴陽 550025;3.貴州醫科大學民族藥與中藥開發應用教育部工程研究中心，貴州貴陽 550004;4.貴州維康子帆藥業股份有限公司，貴州修文 550200)

成骨細胞(osteoblasts，OB)是骨組織中的重要細胞，起源于具有多向分化潛能的骨髓間質細胞，主要作用是負責骨基質的合成、分泌，參與骨礦化。體外培養的成骨細胞是進行抗骨質疏松新藥篩選和藥效學評價的重要模型［1－3］。骨康膠囊是由補骨脂、續斷、三七、芭蕉根、酢漿草組方而成的中藥復方制劑，治療骨質疏松有較好療效，且補骨脂是治療骨質疏松癥的常用藥物，為歷代醫家廣泛應用于各類補腎健骨方，有調節骨轉化，促進成骨細胞增殖等活性［4－5］。本實驗室前期研究發現骨康膠囊中的補骨脂和酢漿草成分對體外培養的成骨細胞的增殖、分化和礦化有促進作用［6－7］，為進一步了解骨康膠囊的促骨形成作用機制，本實驗以骨康膠囊處方中的其他三味藥材續斷、三七和芭蕉根為研究對象，以成骨細胞的增殖、分化和礦化為指標，觀察組方中的單味藥材對成骨細胞SaOS-2增殖、分化和礦化的影響，為骨康膠囊的組方優化提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞與試劑 SaOS-2人成骨肉瘤細胞株購自武漢普諾賽科技生物有限公司，McCoy’s 5a培養基購自上海生工生物工程股份有限公司，胎牛血清、胰蛋白酶、青－鏈霉素，購自美國Gibco公司，堿性磷酸酶(ALP)檢測試劑盒購自南京建成生物科技有限公司，Triton X-100、噻唑藍(MTT)購自Solarbio公司，BCA蛋白定量試劑盒、哺乳動物蛋白抽提試劑盒均購自中國康為世紀公司，茜素紅購自sigma公司，人骨鈣素(OTC)ELISA試劑盒、人鈣離子(Ca2+)ELISA試劑盒均購自上海藍基公司。

1.1.2 儀器 EL204電子天平(上海梅特勒－托利多儀器有限公司)，CO2細胞培養箱(美國Thermo scientific公司)，TS-100F熒光倒置顯微鏡(日本Nikon公司)，Allegra 64R冷凍高速離心機(美國Beckman公司)，680型酶標儀(Bio-Rad公司)。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 人成骨肉瘤細胞SaOS-2用含體積分數10%胎牛血清、1%青霉素－鏈霉素的McCoy＇s 5a培養基，在 37 ℃，5%CO2培養箱中培養，將細胞分為對照組及芭蕉根、續斷、三七給藥組，在SaOS-2細胞增殖實驗中，給藥組分別以1、10、100、200、400 和 800 mg/L 芭蕉根、續斷、三七作用于SaOS-2細胞，對照組加入不含藥培養基。

1.2.2 藥物配制 芭蕉根、續斷、三七提取物由貴州維康子帆藥業股份有限公司提供，用DMSO配制成含芭蕉根、續斷、三七生藥量為1 g/mL的溶液，于－20℃保存備用，實驗時用培養基稀釋至相應的終濃度(DMSO含量小于5‰)。

1.2.3 SaOS-2細胞增殖檢測 采用MTT法。取對數生長期各組SaOS-2細胞接種于96孔板，1×104個/孔，每組5孔，培養24 h后換液;繼續培養48 h后，加入MTT液20μL，繼續培養4 h;棄去培養液后加DMSO 100μL/孔，于490 nm波長檢測各組吸光度值。

1.2.4 SaOS-2細胞ALP活性測定 取對數生長期的SaOS-2細胞接種于24孔板，10×104個/孔。培養24 h后，各給藥組更換為含生藥濃度的終濃度分別為10、100及200 mg/L的培養基，對照組為不含藥培養基，每個濃度5孔;繼續培養48 h后，棄上清培養液，培養板用PBS清洗2遍，每孔加入200 μL 0.1%Triton X-100，于冰上裂解10 min，取上清液，用ALP試劑盒測定細胞ALP活性，并用BCA試劑盒測定細胞裂解液中的蛋白質含量。用堿性磷酸酶/蛋白總濃度表示ALP的活性。

1.2.5 SaOS-2細胞Ca2+和OTC檢測 采用ELISA法。取對數生長期的SaOS-2細胞接種于24孔板，10×104個/孔;培養24 h后，更換為各組含藥培養基，藥物濃度同1.2.5，每組5孔;培養48 h后棄培養液，用PBS洗滌2次，加入哺乳動物蛋白抽提試劑200μL，冰浴10 min。取上清液按人鈣離子ELISA試劑盒和人骨鈣素ELISA試劑盒說明分別測定細胞Ca2+和OTC含量。

1.2.6 SaOS-2細胞礦化結節數測定 采用茜素紅染色法。取對數生長期的SaOS-2細胞接種于24孔板，30×104個/孔，培養24 h后，更換為各組含藥培養基，藥物濃度同1.2.5，每組5孔，隔天更換一次培養基，連續觀察2周，待形成大量的礦化結節后，棄培養液，加PBS清洗2遍，95%乙醇固定10 min，蒸餾水洗滌3次后，加pH 8.3的0.1%茜素紅-Tris-HcL染色30 min，蒸餾水洗滌、干燥，最后于顯微鏡下觀察各孔礦化結節的數目。

1.3 統計學方法

所有數據采用SPSS 18.0軟件進行處理，結果用均數±標準差(±s)表示，組間比較采用單因素方差分析和t檢驗。P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 SaOS-2細胞增殖

與對照組比較，芭蕉根水提物濃度在1～800 mg/L時SaOS-2細胞增殖活性無明顯變化(P＞0.05)。續斷水提物濃度在10～200 mg/L時能顯著增高SaOS-2細胞增殖活性(P＜0.01)，濃度為200 mg/L時，增殖促進作用達最大，濃度至800 mg/L時，SaOS-2細胞的增殖被明顯抑制(P＜0.01)。三七水提物濃度在1～400 mg/L時對SaOS-2細胞增殖活性無明顯影響(P＞0.05)，濃度至800 mg/L時，SaOS-2細胞的增殖被明顯抑制(P＜0.01)。見表1。

表1 骨康膠囊組方中續斷、芭蕉根及三七對SaOS-2細胞增殖的影響( ± s，n=5)Tab.1 The Effects of Dipsacus asper，Panaxnotoginseng and Musa basjoo Sieb on Saos-2 proliferation

表1 骨康膠囊組方中續斷、芭蕉根及三七對SaOS-2細胞增殖的影響( ± s，n=5)Tab.1 The Effects of Dipsacus asper，Panaxnotoginseng and Musa basjoo Sieb on Saos-2 proliferation

(1)與對照組比較，P＜0.01

組別 細胞增殖(%)續斷 芭蕉根 三七對照組100.00±0.53 100.00±0.53 100.00±0.53 1 mg/L組 99.88±0.33 99.99±0.75 101.54±0.98 10 mg/L組 106.00±0.64(1)100.01±0.15 98.35±0.74 100 mg/L組 115.431±0.67(1)100.01±0.51 99.88±0.57 200 mg/L組 118.39±0.56(1)98.89±0.46 101.78±0.74 400 mg/L組 105.39±0.56(1)100.09±0.67 99.03±0.66 800 mg/L組 94.11±0.65(1)97.01±0.53 91.78±0.74(1)

2.2 SaOS-2細胞ALP活性

由MTT檢測結果可知，續斷及三七水提物組SaOS-2細胞的增殖隨著藥物濃度的增大而受到明顯抑制，故以10、100和200 mg/L為各實驗組的低、中、高濃度，檢測SaOS-2細胞 ALP活性，結果顯示，與對照組比較，續斷水提物組的低、中、高濃度能提高ALP水平(P＜0.05或P＜0.01)，芭蕉根、三七水提物的低、中、高濃度對 SaOS-2細胞ALP水平無明顯影響(P＞0.05)。見圖1。

圖1 骨康膠囊組方中不同濃度續斷、芭蕉根及三七對SaOS-2細胞ALP活性的影響Fig.1 The Effects of Dipsacus asper，Panax notoginseng and Musa basjoo Sieb on ALP activity of Saos-2 proliferation

2.3 SaOS-2細胞Ca2+和OTC

Ca2+檢測結果表明，與對照組比較，各濃度的續斷水提物對SaOS-2細胞Ca2+的分泌有非常明顯的促進作用(P＜0.01)，芭蕉根、三七水提物的低、中、高濃度對SaOS-2細胞鈣離子分泌均無明顯影響(P＞0.05)，見表2。OTC檢測結果表明，與對照組比較，續斷水提物低濃度組對SaOS-2細胞OTC分泌無明顯影響，中、高濃度組可增加SaOS-2細胞OTC分泌(P＜0.05或P＜0.01);三七水提物低、中濃度組對OTC分泌無明顯影響，高濃度有明顯促進OTC分泌的作用(P＜0.05);芭蕉根水提物各濃度對OTC分泌無明顯變化，見表3。

表2 骨康膠囊組方中不同濃度續斷、芭蕉根及三七對SaOS-2細胞Ca2+分泌的影響( ± s，n=5)Tab.2 The Effects of Dipsacus asper，Panax notoginseng and Musa basjoo Sieb on Ca2+secretion

表2 骨康膠囊組方中不同濃度續斷、芭蕉根及三七對SaOS-2細胞Ca2+分泌的影響( ± s，n=5)Tab.2 The Effects of Dipsacus asper，Panax notoginseng and Musa basjoo Sieb on Ca2+secretion

(1)與對照組比較，P＜0.01

組別 Ca2+(μg/L)續斷 芭蕉根 三七對照組25.25±1.47 25.25±1.47 25.25±1.47 10 mg/L組 80.59±6.97(1)23.81±2.75 25.49±2.73 100 mg/L組 178.66±6.43(1)24.15±1.67 26.11±2.41 200 mg/L組 140.72±5.81(1)26.04±1.98 28.26±3.10

表3 骨康膠囊組方中不同濃度續斷、芭蕉根及三七對SaOS-2細胞OTC分泌的影響( ± s，n=5)Tab.3 The Effects of Dipsacus asper，Panaxnotoginseng and Musa basjoo Sieb on OTC secretion

與對照組比較，(1)P＜0.05，(2)P＜0.01

組別 OTC(μg/L)續斷 芭蕉根 三七對照組11.41±0.63 11.41±0.63 11.41±0.63 10 mg/L組 13.58±0.75 10.98±0.63 11.50±0.49 100 mg/L組 14.58±0.69(1)11.78±0.57 12.36±0.61 200 mg/L組 15.32±0.76(2)12.78±0.48 14.29±0.44(1)

2.4 SaOS-2細胞礦化結節數

培養2周后，各給藥組細胞礦化結節染色結果呈陽性。與對照組比較，續斷水提物中、高濃度組的礦化結節數目明顯高于對照組(P＜0.05)，而續斷水提物低濃度組和三七、芭蕉根水提物的各濃度組對礦化結節數目形成無明顯影響(P＞0.05)。見表4。

表4 骨康膠囊組方中不同濃度續斷、芭蕉根及三七對SaOS-2細胞礦化結節形成的影響( ± s，n=5)Tab.4 The Effects of Dipsacus asper，Panax notoginseng and Musa basjoo Sieb on Ca2+secretion

表4 骨康膠囊組方中不同濃度續斷、芭蕉根及三七對SaOS-2細胞礦化結節形成的影響( ± s，n=5)Tab.4 The Effects of Dipsacus asper，Panax notoginseng and Musa basjoo Sieb on Ca2+secretion

(1)與對照組比較，P＜0.05

組別 礦化結節數(n)續斷 芭蕉根 三七對照組4.20±0.60 4.20±0.60 4.20±0.60 10 mg/L 6.08±0.49 3.80±0.36 5.50±0.66 100 mg/L 8.92±0.58(1) 4.80±0.55 4.36±0.45 200 mg/L 10.10±0.37(1)3.91±0.46 6.00±0.74

3 討論

中藥復方是傳統中醫樸素的系統思想的產物，通過不同藥物之間的配伍產生不同的療效，且各藥物的劑量不同，也有可能會表現出不同的藥效。因此，在組方優化過程中，探明復方藥物中某一藥效起作用的主要藥物顯得尤為重要。

MTT法表明，在濃度小于800 mg/L時，續斷水提物對成骨細胞增殖有很明顯的促進作用，而芭蕉根與三七水提物作用不明顯;而較高濃度(800 mg/L)時，各給藥組SaOS-2細胞的增殖被明顯抑制，說明各給藥組高濃度對于成骨細胞可能具有一定的毒性。這可能是因為高濃度的藥材水提物中，對細胞產生毒性的有關成分含量也有所增加。

ALP是主要分布于細胞膜的鈣結合轉運蛋白，與細胞成熟及骨的鈣化作用密切相關，被認為是細胞外基質成熟的早期標志;OTC是由成骨細胞合成和分泌的一種活性多肽，是骨質鈣化必需的因子，起到維持骨組織正常礦化的作用［8－9］。因此，ALP和OTC分別是成骨細胞早期和中期分化的標志物［10］。與對照組比較，續斷水提物各濃度均能顯著增加ALP的活性，且能有效的促進OTC的分泌，與程志安等［11］的研究結果一致;三七水提物除了高濃度對成骨細胞OTC的分泌有明顯的促進作用外，其余濃度對ALP活性及OTC的分泌作用與對照組相比差異均無統計學意義，而吳麗萍等［12］的研究表明三七總甙可促進成骨細胞的增殖和分化，這可能是由于三七水提物中的三七總甙含量不高所致。類似的，在細胞Ca2+分泌的檢測中，續斷水提物各濃度對Ca2+分泌有明顯的促進作用，而三七、芭蕉根水提物與對照組相比無明顯差異。礦化結節的形成是成骨細胞分化的最后階段，包括膠原的沉積和基質的礦化兩個步驟。被認為是成骨細胞分化成熟的晚期標志［13］。培養2周后，各給藥組礦化結節染色結果呈陽性;與對照組比較，除芭蕉根水提物外，各組均有增加成骨細胞礦化結節的趨勢。

綜上所述，骨康膠囊組方中的續斷可以顯著促進體外培養的成骨細胞SaOS-2的增殖、分化和礦化。結合之前的研究，提示續斷、補骨脂和酢漿草可能為骨康膠囊促成骨細胞骨形成的主要作用藥物，而三七及芭蕉根在骨康膠囊抗骨質疏松中的作用有待進一步研究。