單次小劑量匹羅卡品對實驗大鼠杏仁核電活動及海馬組織的影響*＊

康楊婷，黃媛馨，伍國鋒

(1.貴州醫科大學，貴州貴陽 550004;2.貴州醫科大學附院急診神經科，貴州貴陽 550004)

癲癇(epilepsy，EP)是多種原因導致的以腦部神經元高度同步化異常放電為主要表現的臨床綜合征［1］，伴有短暫的運動、感覺、意識及自主神經功能異常，具有病因多樣性、發作反復性、癥狀復雜性、表現形式單一等特點［2］。目前常用氯化鋰－匹羅卡品腹腔注射建立EP大鼠模型，使用單次大劑量匹羅卡品腹腔注射可以獲得較高的致癇性動物模型，但致死率較高［3－4］。相關文獻報道，小劑量反復腹腔注射匹羅卡品可建立大鼠顳葉EP模型，能夠獲得較高致癇率及較低致死率［4－6］，但關于單次小劑量匹羅卡品對大鼠大腦影響的研究目前尚未發現。本研究旨在探討單次予以小劑量匹羅卡品對實驗大鼠杏仁核電活動及海馬組織的影響。

1 材料與方法

1.1 動物

健康成年雄性SD大鼠40只、SPF級、體質量180～220 g、日齡60～90 d，由貴州醫科大學實驗動物中心提供。保持實驗室內溫度22～26℃，濕度恒定。采用單籠喂養、自由進食，讓動物適應環境。

1.2 方法

1.2.1 分組、給藥及記錄腦電波 將40只大鼠隨機均分為正常對照組(NC組)與小劑量匹羅卡品實驗組(PC組)，立即在兩組動物中分別在杏仁核植入記錄電極。PC組大鼠在術后第7天腹腔注射氯化鋰125 mg/kg，18 h后再給予腹腔注射10 mg/kg匹羅卡品;NC組在術后第7天僅予以相同次數、相同劑量的生理鹽水腹腔注射，不予注射氯化鋰－匹羅卡品。

1.2.2 標本處理 于藥物處理后2周末，采集SD大鼠杏仁核區的腦電圖。用10%的水合氯醛麻醉大鼠后，將大鼠固定、暴露胸腔，用眼科剪剪開大鼠的右心耳處，經大鼠左心室快速灌注0℃預冷的生理鹽水500 mL置換出體內的血液，待右心耳缺口處流出清亮液體后，用預先配置好的PBS 500 mL灌注，灌注結束后斷頭取腦，迅速分離出海馬組織。將一側海馬組織浸泡于4%多聚甲醛EP管中，4℃冰箱中固定過夜;另一側海馬組織冷凍之后裝入無酶的EP管中，于－80℃冰箱中保存備用做Western Blot檢測γ－氨基丁酸A(GABAA)受體。

1.3 觀察指標

1.3.1 記錄腦電圖波幅及頻率 兩組大鼠均在藥物注射后第7天描記腦電圖1 h，首先連續記錄15 min，然后每隔5 min記錄10 min，1 h內完成。腦電圖資料用隨機軟件計算出波幅和頻率。

1.3.2 海馬神經元細胞數及GABAA受體 將予以多聚甲醛處理的組織用自來水反復沖洗后，用75%的酒精中行常規脫水24 h，分別浸泡在二甲苯Ⅰ透明化處理60 min和二甲苯Ⅱ中透明化處理40 min，再進行包埋切片。將組織蠟塊切成5μm厚的薄片置于用多聚賴氨酸包被的載玻片上，放在60℃的恒溫烤箱中烘烤1 h，室溫下復溫1 h后透明處理15 min，將脫蠟后的切片經100%、95%、85%、75%的酒精分別浸泡5 min，純水沖洗10 min，并將切片放入事先預熱至60℃1%甲苯胺藍染液中浸染30 min。浸染結束后，純水沖洗6 min，然后經95%的酒精迅速分化1 min，無水乙醇脫水、透明、中興樹膠封片。通過顯微鏡拍照，觀察海馬細胞數以及GABAA受體的表達。

1.3.3 檢測GABAA受體 稱取約10 mg的海馬組織置于事先預冷的EP管內，向EP管中加入200μL預冷的蛋白裂解液、再加入蛋白酶抑制劑2μL，充分混勻后置于冰上超聲破碎儀破壞海馬組織。用高壓滅菌后的移液器槍頭將研磨好的組織液轉移至一個新的預冷的EP管中，配平后放入4℃離心機中，14 000 r/min離心5 min，將上清液轉移至新的離心管中進行蛋白質含量的測定，采用 BCA分光光度法來測定蛋白質含量。測量完畢后置于－80℃冰箱中冷凍保存，然后制膠、加樣，通過凝膠電泳、轉膜、孵育抗體及曝光處理后觀察兩組大鼠的海馬組織中的GABAA受體的表達。

1.4 統計學處理

應用SPSS13.0軟件分析數據，所測得數據采用獨立樣本t檢驗，結果用均值±標準差(±s)表示，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 行為學表現

PC組大鼠予以小劑量匹羅卡品腹腔注射后，未發現大鼠有點頭、肢體抽搐等行為學改變;NC組予以相同劑量的生理鹽水處理后也未觀察到異常行為學變化。

2.2 腦電圖波幅及頻率

兩組大鼠藥物處理后第7天，PC組大鼠杏仁核后放電的頻率及波幅均明顯高于NC組，差異有統計學意義(P＜0.05)，見表1。

表1 兩組大鼠腹腔注射后杏仁核后放電的波幅及頻率(±s)Tab.1 Amplitude and frequency of posterior amygdaloid discharges after intraperitoneal injection in rats of both groups

表1 兩組大鼠腹腔注射后杏仁核后放電的波幅及頻率(±s)Tab.1 Amplitude and frequency of posterior amygdaloid discharges after intraperitoneal injection in rats of both groups

分組 杏仁核后放電波幅(μV)杏仁核后放電頻率(Hz)PC組50.69 ±0.52 8.8 ±1.1 NC 組 20.8 ±0.84 5.0 ±0.7 t－67.480 6.517 P 0.000 0.000

2.3 海馬神經元細胞數

注射2周后，PC組SD大鼠在CA1、CA3、CA4區的海馬神經元細胞數較NC組明顯減少，海馬椎體細胞數量也明顯減少，差異有統計學意義(P＜0.05)，見圖1、圖 2。

圖1 注射兩周后兩組大鼠海馬神經元(×200)Fig.1 Hippocampal neuron of rats in both groups

圖2 注射兩周后兩組大鼠海馬椎體細胞數Fig.2 Number of hippocampal vertebrae cells of rats in both groups

2.4 海馬GABAA受體

對兩組大鼠海馬組織GABAA受體的免疫熒光發現，PC組大鼠海馬細胞總數較NC組減少，且PC組海馬組織GABAA受體的表達量明顯低于NC組，差異有統計學意義(P＜0.05)，見圖3。Werstern blot檢測GABAA受體表達結果顯示，PC組大鼠海馬組織GABAA受體表達較NC組明顯減少，差異有統計學意義(P＜0.05)，見圖4。

3 討論

圖3 兩組大鼠海馬組織GABAA受體平均光密度(免疫熒光)Fig.3 Average optical density of GABAA receptor in hippocampus of rats in both groups(immunofluorescence)

圖4 兩組大鼠海馬組織GABAA受體表達(Werstern blot)Fig.4 Expression of GABAA receptor in hippocampus of rats in both groups

EP是國內外常見的中樞神經系統疾病，成功地建立EP動物模型對于探討EP的病因、發病機制、治療具有重大意義。國內外研究中已成功建立多種EP動物模型，如杏仁核點燃模型、海人酸模型、匹羅卡品模型等，查閱相關文獻表明匹羅卡品EP大鼠模型的病理特征與人類顳葉EP非常相似［7］，是最理想的顳葉 EP 動物模型之一［8－9］，它的優勢在于在制造EP模型時，該模型不用經大腦給藥，僅通過腹腔注射便能誘發EP發作。因此，對于在后續實驗中需要進行大腦內慢病毒注射及顱內給藥治療的實驗，該模型是最佳選擇。在正常大鼠中依次予以氯化鋰－大劑量匹羅卡品后，可引起大腦的局限甚至廣泛性損傷，而這種局限或者廣泛性損傷有可能作為EP發作的病灶，從而引發慢性EP的自發性發作。大鼠氯化鋰－匹羅卡品EP模型在行為學、腦電圖、病理特性上與人類顳葉EP非常相似，并且具有制作簡單、誘發迅速、表現典型、癇性發作容易確認等優點，因此近年來一直被用于EP發病機制和抗EP藥物的研究的較為理想的顳葉 EP模型［10－11］。雖然單次予以大劑量(30 mg/kg)的匹羅卡品致癇性高，但同時死亡率高，不利于用于EP模型的研究［12－13］，因此較高的死亡率成為該模型的最大弊端。大量的文獻報道制備EP模型的匹羅卡品的劑量接近其致死量，從而導致了該模型的較高的死亡率，因此國內外學者致力于如何減少氯化鋰－匹羅卡品EP模型的死亡率。國內外的相關報道發現氯化鋰－反復小劑量(10 mg/kg)匹羅卡品制備EP模型可以明顯降低大鼠的死亡率，提高大鼠的EP發病率，使急性期大鼠EP持續狀態的發生率明顯提高，而死亡率有所下降［14］。國內外研究主要致力于氯化鋰－大劑量匹羅卡品EP模型和氯化鋰－反復小劑量匹羅卡品模型的研究，而單次小劑量匹羅卡品對大鼠杏仁核后放電以及海馬組織的影響的研究尚未發現。給予小劑量的匹羅卡品后，根據相關文獻報道幾乎未發現大鼠會有相關癇性發作［14－15］。本研究通過對小劑量匹羅卡品大鼠的海馬組織的研究，結果發現小劑量匹羅卡品可以損傷大鼠的的海馬組織，從而證明反復小劑量匹羅卡品模型可以引起大鼠大腦的廣泛性損傷，使大鼠EP發作;反復小劑量給予匹羅卡品可以減少匹羅卡品藥物過量的發生率，降低匹羅卡品模型的死亡率;通過研究表明小劑量匹羅卡品給予后可以使大鼠杏仁核后放電的頻率及波幅均明顯增加，海馬神經元細胞的數量以及GABAA受體的表達均明顯減少，從而說明小劑量匹羅卡品能增強大鼠的杏仁核電活動并導致海馬神經元的丟失，減少GABAA受體的表達，從而可能提高大鼠的EP易發性。

綜上，單次小劑量氯化鋰－匹羅卡品腹腔注射更容易誘發實驗大鼠的EP發作。這是因為單次小劑量匹羅卡品能增強大鼠的杏仁核電活動并導致海馬神經元的丟失，減少GABAA受體的表達，這可能是小劑量單次注射匹羅卡品致癲癇發生的機制之一。